趋化因子CCL2对血小板功能的调控及其机制研究

发布时间：2017-06-25 14:15

  本文关键词：趋化因子CCL2对血小板功能的调控及其机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是严重威胁人类健康和生命的重大疾病之一,由于其高发病率、高致残率和高死亡率,AMI已成为我国重大的公共卫生问题。血小板聚集和活化在AMI斑块及血栓形成过程中扮演重要角色。近年来,经皮冠状动脉介入联合双联抗血小板治疗(阿司匹林+氯吡格雷)已成为AMI的主要治疗措施之一,不仅能有效缓解AMI患者的临床症状,还能显著改善患者的预后。然而,4%-30%人群对氯吡格雷的反应性低下甚至无反应,这种现象被称为氯吡格雷抵抗(clopidogrel resistance,CR),这部分患者发生心血管事件的风险明显增加。增加氯吡格雷剂量、使用三联的抗血小板药物(阿司匹林+氯吡格雷+西洛他唑)或使用新型抗血小板药物替格瑞洛后能有效降低CR患者发生心血管事件的风险,但并不能完全消除上述事件的发生,提示CR患者在经过优化的抗血小板治疗后仍然存在一定程度的血小板聚集和活化。因此,从血小板聚集和活化角度入手,寻找对抗血小板功能的关键调控分子及信号通路,可以为AMI等心血管疾病的防治提供新的策略和依据。CC类趋化因子配体2(C-C motif ligand 2,CCL2),又称单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1),是目前研究最广泛的趋化因子之一。CCL2在动脉粥样硬化形成、血管再生、心脏损伤与修复中均发挥重要作用。CCL2在急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome,ACS)患者血浆的表达显著高于正常对照,并且其表达水平与ACS患者发生心血管事件的风险及临床结局密切相关。CCL2及受体CCR2在人动脉粥样硬化斑块组织的表达也显著高于正常动脉组织。随后研究也在动物水平证实了CCL2及CCR2在动脉粥样硬化中的重要作用。上述研究结果表明,CCL2及受体CCR2在动脉粥样硬化和ACS等心血管疾病的发病中具有重要作用。然而,CCL2是否通过影响血小板聚集和活化等功能参与AMI的发生发展,目前未见相关报道。为深入明确CCL2对血小板功能的影响,本研究首先检测CCL2在ST段抬高型心肌梗死患者(ST-elevation myocardial infarction,STEMI)血浆及罪犯冠状动脉内血栓组织中的表达。接下来以20例健康志愿者为研究对象,采用RT-PCR、Western Blot、免疫组织化学、免疫荧光染色、光学比浊法、流式细胞术和ELISA等方法,检测CCL2对血小板聚集、活化、颗粒分泌和粘附功能的影响,以及PKCα-P38MAPK信号通路在其中发挥的调控作用等方面进行研究。本研究通过阐明CCL2对血小板功能的影响及其机制,不仅可能为AMI等心血管疾病的诊断和防治提供依据,还试图为寻找新型的抗血小板药物提供新的靶点和策略。本课题的主要研究内容和结果如下:1、CCL2在STEMI患者血浆及罪犯冠状动脉内血栓组织的表达显著高于对照组(1)本部分以40例STEMI患者以及40例年龄与性别相匹配的健康对照为研究对象。分析STEMI组和对照组的临床基线资料发现,STEMI组吸烟史比例、高血压病史比例以及空腹血糖水平均显著高于对照组(吸烟史:p=0.014;高血压病史:p=0.004;空腹血糖水平:p=0.003),其余指标包括BMI和血脂水平等均无明显的统计学差异。采用ELISA方法检测CCL2在STEMI患者及对照组血浆中的表达。结果显示CCL2在STEMI患者血浆的表达显著高于对照组(299.17±78.73 pg/ml vs.177.00±30.92 pg/ml,n=40,p0.01),具有显著的统计学意义。(2)应用抽吸导管方法收集10例STEMI患者罪犯冠状动脉内的血栓组织,同时收集上述10例患者非罪犯冠状动脉内的动脉血,体外实验制备STEMI患者非罪犯冠状动脉血凝块作为本部分的对照。采用实时荧光定量PCR、Western Blot、免疫组织化学及免疫荧光染色方法检测CCL2及受体CCR2在STEMI患者罪犯冠状动脉内血栓组织的表达及定位情况。结果提示,在STEMI患者罪犯冠状动脉的血栓组织中,CCL2及CCR2的m RNA和蛋白水平均显著高于其自身非罪犯冠状动脉的血凝块,具有显著的统计学意义(n=10,p0.01)。同时研究还发现,在STEMI患者罪犯冠状动脉的血栓组织中,CCL2及CCR2均能与血小板活化标志物CD62p存在共定位表达。上述结果表明,CCL2在STEMI患者血浆及罪犯冠状动脉内血栓组织的表达显著高于对照组,提示CCL2在STEMI患者冠状动脉血栓的发生发展中可能具有重要作用。2、CCL2促进血小板聚集、活化、颗粒分泌和粘附(1)本部分纳入20例健康志愿者,应用CD45+磁珠分离获得纯化的血小板后,采用RT-PCR、Western Blot和免疫荧光染色检测CCL2的受体CCR2在人血小板上的表达情况。本研究首次证实CCR2在健康人血小板上有明显表达。(2)以20例健康志愿者为研究对象,用CCL2重组因子刺激血小板后,采用光学比浊法、流式细胞术和ELISA等方法检测CCL2对血小板聚集、活化、颗粒分泌及粘附功能的影响。与基线组比,CCL2浓度为100 ng/ml时可明显增加血小板聚集率(15.03±2.44%vs.6.92±2.12%,n=20,p0.01),随着CCL2浓度的增加,血小板聚集率也逐渐增加,呈剂量依赖模式。因此,选择100 ng/ml作为CCL2的后续实验浓度。采用流式细胞术检测CCL2对血小板早期活化标志物PAC-1和血小板晚期活化标志物CD62p表达的影响。结果发现,与基线组相比,CCL2能显著增加血小板PAC-1(20.54±3.18%vs.10.23±2.58%,n=20,p0.01)和CD62p的表达(7.95±2.19%vs.5.12±0.69%,n=20,p0.01)。应用ELISA方法检测CCL2对血小板α颗粒分泌指标CD40L和致密颗粒分泌指标TXB2表达的影响。与基线组相比,CCL2可显著增加血小板CD40L(160.09±19.66pg/ml vs.73.58±6.48 pg/ml,n=20,p0.01)和TXB2的表达(23.44±7.38 ng/ml vs.9.62±5.55 ng/ml,n=20,p0.01)。研究还发现CCL2能显著增加与内皮细胞粘附的血小板数目(54.25±8.42 vs.18±2.94,n=20,p0.01)。(3)应用CCL2中和抗体或CCR2拮抗剂(RS102895)预处理血小板后,采用光学比浊法、流式细胞术和ELISA等方法检测两者对血小板功能的影响。与CCL2组相比,CCL2中和抗体能显著抑制血小板聚集率(9.33±1.72%,n=20,p0.01)、血小板活化指标PAC-1和CD62p的表达(PAC-1:11.58±1.87%;CD62p:5.35±0.53%,n=20,p0.01)、血小板颗粒分泌指标CD40L和TXB2的表达(CD40L:87.88±12.01 pg/ml;TXB2:11.77±2.77 ng/ml,n=20,p0.01),以及血小板与内皮细胞的粘附(27.25±8.66,n=20,p0.01)。此外,RS102895也能显著降低血小板聚集率(10.58±2.07%,n=20,p0.01)、活化指标PAC-1和CD62p的表达(PAC-1:12.55±1.62%;CD62p:5.48±0.83%,n=20,p0.01)、血小板颗粒分泌CD40L和TXB2的表达(CD40L:85.69±14.68 pg/ml;TXB2:12.02±3.11 ng/ml,n=20,p0.01),以及血小板与内皮细胞的粘附(30±6.27,n=20,p0.01)。(4)在经典的血小板诱导剂ADP或Collagen存在时,观察CCL2与ADP或Collagen对血小板功能的影响是否存在协同作用。与ADP组相比,CCL2与ADP联合作用能更显著的促进血小板聚集率(60.2±6.06%vs.43.15±8.58%,n=20,p0.01)、血小板活化标志物PAC-1和CD62p的表达(PAC-1:53.85±7.64%vs.39.34±5.31%;CD62p:34.77±2.79%vs.27.56±1.73%,n=20,p0.05)、血小板颗粒分泌指标CD40L(425.37±64.58 pg/ml vs.201.61±34.48 pg/ml;n=20,p0.01)和TXB2的表达(41.88±5.09ng/ml vs.31.24±6.74 ng/ml,n=20,p0.05)。与Collagen组相比,CCL2与Collagen联合作用也能更显著增加血小板聚集率(69.53±4.65%vs.53.28±9.69%,n=20,p0.01)、血小板活化指标PAC-1的表达(57.14±10.72%vs.41.34±8.00%,n=20,p0.05)、以及血小板CD40L(449.03±47.88 pg/ml vs.218.57±46.52 pg/ml,n=20,p0.01)和TXB2的表达(51.53±8.72 ng/ml vs.34.43±9.08 ng/ml,n=20,p0.05)。上述结果提示,CCL2能显著促进血小板聚集、活化、颗粒分泌以及粘附,这些作用可以被CCL2中和抗体或CCR2拮抗剂RS102895所抑制。在对血小板功能的影响过程中,CCL2与ADP或Collagen存在一定的协同效应。3、PKCα-P38MAPK信号通路介导CCL2对血小板功能的调控(1)鉴于PKCs、MAPKs和PI3K/AKT信号通路在调控血小板活化和颗粒分泌等方面的重要作用,采用Western Blot方法检测CCL2对血小板PKCs、MAPKs和PI3K/AKT信号分子磷酸化水平的影响。结果显示CCL2显著增加血小板磷酸化PKCα和P38MAPK的表达(n=5,p0.05),而磷酸化PKCβII、ERK1/2、JNK1/2、PI3K和AKT的表达无明显改变,总PKCα、PKCβII、P38MAPK、ERK1/2、JNK1/2、PI3K和AKT的表达也无明显变化。应用CCL2中和抗体和CCR2拮抗剂RS102895预处理血小板后,采用Western Blot方法检测血小板磷酸化PKCα和P38MAPK的表达水平。发现CCL2中和抗体和RS102895均能显著降低血小板磷酸化PKCα和P38MAPK的表达(n=5,p0.01)。上述结果表明CCL2可诱导血小板PKCα-P38MAPK通路的活化。(2)应用PKCα抑制剂(RO318220)或P38MAPK选择性抑制剂(SB203580)预处理血小板后,采用Western Blot方法检测血小板磷酸化PKCα和P38MAPK的表达。实验表明RO318220能显著降低CCL2对血小板磷酸化PKCα和P38MAPK表达的影响;SB203580仅能降低血小板磷酸化P38MAPK的表达,对磷酸化PKCα的表达无影响。应用光学比浊法、流式细胞术和ELISA等方法检测RO318220或SB203580对血小板聚集、活化、颗粒分泌及粘附的影响。与CCL2组相比,RO318220显著降低CCL2对血小板聚集率(8.67±1.06%,n=20,p0.01)、血小板活化指标PAC-1和CD62p表达的影响(PAC-1:11.08±2.36%;CD62p:4.93±1.92%,n=20,p0.01);RO318220也能明显降低血小板颗粒分泌指标CD40L和TXB2表达(CD40L:85.61±7.91 pg/ml;TXB2:11.82±2.69 ng/ml,n=20,p0.01),以及血小板与内皮细胞的粘附(24.5±8.39%,n=20,p0.01)。同样,SB203580也可显著降低血小板聚集率(7.1±1.51%,n=20,p0.01)、血小板活化指标PAC-1和CD62p(PAC-1:10.77±1.95%;CD62p:4.5±1.05%,n=20,p0.01)、血小板颗粒分泌指标CD40L和TXB2表达(CD40L:87.03±5.51 pg/ml;9.49±1.92 ng/ml,n=20,p0.01)、以及血小板与内皮细胞的粘附(23.75±9.64%,n=20,p0.01)。上述结果提示,CCL2通过活化PKCα-P38MAPK信号通路来参与对血小板聚集、活化、颗粒分泌及粘附功能的调控。综上所述,本课题发现CCL2在STEMI患者血浆及罪犯冠状动脉内血栓组织的表达均显著高于对照组。体外实验首先证实CCL2可显著增加血小板聚集、活化、颗粒分泌以及血小板与内皮细胞的粘附,并且PKCα-P38MAPK信号通路在该过程中发生明显活化。选择性阻断PKCα和P38MAPK信号通路后显著抑制CCL2对血小板聚集、活化、颗粒分泌和粘附功能的影响,提示CCL2通过活化PKCα-P38MAPK信号通路参与对血小板功能的调控。本研究初步揭示了CCL2通过PKCα-P38MAPK信号通路调控血小板的功能,不仅有助于深入认识CCL2在AMI发病中的作用,还可能为寻找新型的抗血小板药物提供靶点和依据。
【关键词】：CCL2 血小板聚集 血小板活化 急性心肌梗死 蛋白激酶C P38MAPK
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R542.22
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 英文摘要6-11
• 中文摘要11-16
• 第一章 前言16-20
• 第二章 CCL2在STEMI患者血浆及罪犯冠状动脉内血栓组织的表达检测20-38
• 2.1 材料与方法21-31
• 2.2 结果31-36
• 2.3 讨论36-37
• 2.4 小结37-38
• 第三章 CCL2对血小板聚集、活化、颗粒分泌及粘附功能的调控研究38-61
• 3.1 材料与方法39-49
• 3.2 结果49-59
• 3.3 讨论59-60
• 3.4 小结60-61
• 第四章 CCL2对血小板功能调控的分子机制研究61-75
• 4.1 材料与方法62-65
• 4.2 结果65-72
• 4.3 讨论72-74
• 4.4 小结74-75
• 全文总结75-77
• 参考文献77-88
• 文献综述 趋化因子CCL2及受体CCR2在心血管疾病中的研究进展88-101
• 参考文献95-101
• 攻读博士学位期间发表及撰写的论文101-102
• 致谢102

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 王执兵;刘俊;陈少源;苏又苏;谢培益;方红城;;冠脉支架术后再狭窄血管重塑与脂联素、单核细胞趋化因子-1和内皮功能的相关性[J];南方医科大学学报;2010年04期

  本文关键词：趋化因子CCL2对血小板功能的调控及其机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

，

本文编号：482437