人类弱精子症精子的容积调节能力、运动能力和氯通道的表达

发布时间：2017-09-19 00:37

  本文关键词：人类弱精子症精子的容积调节能力、运动能力和氯通道的表达

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【摘要】：目的:阐明调节精子功能的机制是诊断和治疗男性不育、开发新型男性避孕手段的先决条件。容积调节能力对于精子的生理功能至关重要,容积敏感性氯通道是决定精子调节能力的关键因素之一,参与健康精子细胞在低渗环境中的容积调节过程。动物实验表明,不育小鼠精子的容积调节能力明显降低。然而人类弱精子的容积调节能力以及氯通道的表达情况尚不清楚。本研究旨在研究人类弱精子症精子在低渗环境中的容积调节能力,以及氯通道在精子容积调节和运动中发挥的作用,并探讨容积敏感性氯通道在弱精子的表达及其在运动中的作用,为临床治疗男性不育以及开发离子通道型男性避孕药提供理论依据。方法:1)根据世界卫生组织(WHO)出版的《人类精液检验与处理实验室手册(第五版)》中实验方法,采用计算机辅助精液分析系统(CASA)进行精液常规分析;2)正常精子和弱精子精液样本均由广东省计划生育专科医院男性实验室和人类精子库提供;3)用计算机辅助精液分析系统(CASA)检测精子的各项运动参数,如精子的前向运动(PR)百分比、直线运动速率(VSL)、曲线运动速率(VCL)、平均路径速率(VAP);4)根据流式细胞术检测到的前向散射信号来反映精子的容积变化;5)用激光共聚焦免疫荧光技术检测氯通道在精子上的表达与定位,并用流式细胞术分析精子氯通道的相对表达量。结果:在等渗液(BWW330)中,正常精子细胞容积维持稳定,改用低渗液(BWW290)孵育,正常人的精子容积几乎没有变化(P0.05),表明正常精子在低渗环境中能够有效地调节自身的容积,恢复细胞的正常大小。然而弱精子在低渗液中的容积明显变大(P0.01),表明在低渗环境下,弱精子不能有效地调节自身的容积。提示弱精子的容积调节机制异常,导致容积调节能力减弱。氯通道阻断剂5-nitro-2-(3-phenylpropylamino)benzoic acid NPPB(100mmol/L)和4,4'-Diisothiocyano-2,2'-stilbenedisulfonic acid DIDS(100mmol/L)均可以显著地抑制正常精子在低渗环境中的调节性容积回缩能力(P0.01),导致正常精子的容积增大;而对弱精子的容积几乎没有影响(P0.05),表明弱精子对氯通道阻断剂不敏感,提示弱精子的氯通道表达(表达量或类型)异常。细胞外渗透压从330 m Osm/kg降低到290 m Osm/kg时,正常精子的多项运动参数如前向运动(PR)百分比、直线运动速率(VSL)、曲线运动速率(VCL)、平均路径速率(VAP)的数值均明显增加,表明正常精子在低渗液中的的运动明显增强,而弱精子动参数如前向运动(PR)百分比、直线运动速率(VSL)、曲线运动速率(VCL)、平均路径速率(VAP)的数值均明显减小,表明弱精子在低渗液中的运动则显著减弱。NPPB和DIDS在等渗液(BWW330)和低渗液(BWW290)中均明显抑制正常精子和弱精子的运动,其中DIDS的抑制作用比NPPB更强,NPPB在BWW290中对正常精子运动的抑制作用大于弱精子。结果提示氯通道的激活在精子运动过程中起重要作用。流式细胞术的检测结果显示,弱精子Cl C-3氯通道蛋白的表达量明显低于正常精子。进一步用激光共聚焦免疫荧光技术定位分析Cl C-3氯通道在精子细胞中的分布,结果显示,Cl C-3氯通道蛋白在正常精子和弱精子的颈部及尾部均有表达,但弱精子颈部Cl C-3的表达明显弱于正常精子细胞(P0.01)。用免疫荧光技术,在正常精子和弱精子细胞中均检测不到Cl C-5和Cl C-7氯通道的表达。结论:1)弱精子在低渗环境下的容积调节能力明显弱于正常精子,氯通道在精子的容积调节过程中起重要作用;2)低渗刺激可以促进正常精子的运动,但弱精子在低渗环境中的运动能力明显降低;3)氯通道是调节精子运动能力重要因素;4)容积敏感性氯通道Cl C-3在正常精子的表达明显强于弱精子,尤其是在精子颈部的表达,提示精子颈部氯通道的激活可能是调节精子运动的关键因素。
【关键词】：弱精子症 细胞容积调节 ClC-3氯通道 精子运动
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R698.2
【目录】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-11
• 1 前言11-26
• 1.1 精子的运动11-14
• 1.1.1 影响精子运动的因素11-13
• 1.1.2 精子运动功能的主要检测方法13-14
• 1.2 弱精子症14-18
• 1.2.1 病因14-18
• 1.2.2 弱精子症的诊断18
• 1.3 细胞的容积调节功能18-22
• 1.3.1 体细胞的容积调节功能18-20
• 1.3.2 精子细胞的容积调节功能20-22
• 1.4 细胞容积的测量22-24
• 1.5 研究目的24-25
• 1.6 研究意义25-26
• 2 实验材料与方法26-37
• 2.1 实验材料26-29
• 2.1.1 临床精液样本的收集与处理26-28
• 2.1.2 实验仪器28-29
• 2.2 常用液体和试剂的配制29-31
• 2.3 精子形态的观察31
• 2.4 精子细胞的孵育31
• 2.5 流式细胞术技术检测精子细胞的容积31-32
• 2.6 精子胞质小滴的观察32-33
• 2.7 计算机辅助精液分析系统（CASA）检测精子的运动情况33-35
• 2.8 免疫荧光技术检测 ClC 通道在人类精子上表达与定位35
• 2.9 流式细胞术检测ClC-3 蛋白在正常精子与弱精子中的表达35-36
• 2.10 统计学方法36-37
• 3 实验结果37-61
• 3.1 精子的形态37-38
• 3.2 精子细胞的容积调节38-41
• 3.2.1 低渗刺激下精子的容积调节能力38-39
• 3.2.2 氯通道阻断剂对精子容积调节的影响39-41
• 3.2.2.1 NPPB对精子容积调节的影响39-40
• 3.2.2.2 DIDS对精子容积调节的影响40-41
• 3.2.2.3 不同渗透压氯通道阻断剂对精子存活率的影响41
• 3.3 精子胞质小滴(CDS)的观察41-42
• 3.4 计算机辅助精液分析系统（CASA）检测精子运动能力的变化42-55
• 3.4.1 正常精子和弱精子在不同渗透压环境中运动能力的改变42-45
• 3.4.2 氯通道阻断剂对等渗环境中正常精子和弱精子运动能力的抑制作用45-50
• 3.4.2.1 NPPB 对等渗液体中正常精子和弱精子运动的抑制作用45-47
• 3.4.2.2 DIDS 对等渗液体中正常精子和弱精子运动的抑制作用47-50
• 3.4.3 氯通道阻断剂对低渗刺激下正常精子和弱精子运动能力的抑制作用50-55
• 3.5 正常精子和弱精子细胞上 ClC 氯通道的表达与定位55-61
• 3.5.1 ClC-3 氯通道在正常和弱精子上的定位情况55
• 3.5.2 ClC-3 蛋白在正常精子和弱精子颈部的表达55-58
• 3.5.3 流式细胞技术检测 ClC-3 氯通道蛋白在正常精子和弱精子上的表达58-59
• 3.5.4 ClC-5 和 ClC-7 氯通道在正常和弱精子上的表达情况59-61
• 讨论61-65
• 结论65-66
• 总结与展望66-67
• 参考文献67-76
• 在校期间科研情况76-77
• 附录 中英文缩略词表77-78
• 致谢78

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