耐比卡鲁胺R3327前列腺癌细胞系雄激素抵抗的研究

发布时间：2017-09-20 09:03

  本文关键词：耐比卡鲁胺R3327前列腺癌细胞系雄激素抵抗的研究

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【摘要】：研究背景：在北欧和美国,前列腺癌目前已经成为成年男性中最高发的恶性肿瘤,并且在多数西方国家中,导致男性癌症患者死亡的恶性肿瘤排行榜中前列腺癌高居第二位,仅次于肺癌,仅仅在2013年美国就有超过29,000名男性患者死于前列腺癌。在我国前列腺癌患者发病率也呈逐年上升的趋势。而随着科技的不断进步,筛查和诊断水平相应快速提高,85%的早期前列腺癌患者都可以及早发现,这部分患者是幸运的。该期病人接受放疗或者根治性手术治疗以后,在理论上是可以达到完全治愈的效果。与之相反的是,很多患者发现时已经不属于早期前列腺癌,这部分进展期前列腺癌患者失去手术或者放疗的机会,转而进行内分泌治疗。目前内分泌治疗的主要方法是应用雄激素受体拮抗类药物,如比卡鲁胺、氟他胺等,初发的前列腺癌多是对内分泌治疗敏感,但经过一段时间治疗后,这部分激素依赖性前列腺癌多数要转化为激素非依赖性前列腺癌(CRPC),一旦转变成为后者则患者预后极差,中位生存时间平均仅有16到18个月。对于CRPC患者的研究从来没有停止,但目前对这部分患者的中位生存时间改善并不明显。CRPC的形成机制目前仍不清楚,是前列腺癌研究方面的一个热点。线粒体在其中发挥的作用逐渐引起重视。线粒体本身包含自己的基因组,并且是生命生存所需要的最基本的、同时也是相对比较复杂的细胞器。人体内最基本生化反应如：能量产生、凋亡、氨基酸和脂类的合成都在线粒体内发生,因此,科学家们有理由怀疑线粒体的新陈代谢功能障碍或者功能失调可以导致肿瘤对药物治疗的反应下降,并且增加肿瘤的恶性程度和侵袭性。在前列腺癌方面现有研究证明,线粒体DNA (mtDNA)的突变,包括：点突变、多段缺失和DNA耗尽都可以加速肿瘤发展和远处转移。特别是近年来有研究发现,mtDNA的突变可以导致激素依赖性前列腺癌转变成为激素非依赖性前列腺癌,而体外研究也进一步证实,细胞内每减少10-100个mtDNA的拷贝就可以导致细胞内氧耗量下降,整个细胞的内环境由乏氧状态变为高氧状态,进一步激活甲羟戊酸途径和原癌基因Ras,继发激活ERK, AKT,NF-Kb和JNK途径,使正常增殖的细胞发生突变,转而表现出恶性表型。研究目的：本试验研究中,我们用治疗量浓度的雄激素受体拮抗剂R-比卡鲁胺长期体外培养前列腺癌雄激素敏感性细胞系R3327-H,通过多次传代,最终成功诱导建立了R3327-H的亚系-耐R-比鲁胺的R3327细胞亚系(R3327-Rb ic)并检测R3327-Rbic的细胞形态、侵袭性。将R-比卡鲁胺与R3327-H和R3327-Rbic细胞进行共同培养后,运用基因芯片技术,研究了在此过程中雄激素受体(AR)、线粒体DNA (mtDNA)基因突变的情况,比较了两种细胞增殖过程中AR以及线粒体调节相关蛋白Drp-1表达的变化情况,并应用realtime RT-PCR技术,weston-blot技术验证基因测序所得出的结果,部分阐明了R3327-H前列腺癌细胞由激素敏感性转变成为激素抵抗性过程中mtDNA、AR的突变情况,明确了这一过程中氧化呼吸链相关蛋白的表达情况。实验建立了R-比卡鲁胺耐受性前列腺癌细胞系R3327-Rbic及R-比卡鲁胺耐受细胞系的动物模型,进一步来研究了雄激素敏感性细胞系R3327-H在R-比卡鲁胺的作用下产生药物耐受性的机理,从而为今后的对于CRPC的研究奠定了理论基础,为CRPC的患者的进一步治疗提供细胞系和动物实验基础,为CRPC的治疗提供便利条件。研究方法：1、R-比卡鲁胺对前列腺癌细胞R3327-H和R3327-Rbic的作用及R3327-Rbic细胞的特性：1)应用电子显微镜观察R-比卡鲁胺作用于R3327-H后形成的R3327-Rbic细胞形态学方面发生的变化。2)R-比卡鲁胺在两种细胞中浓度不断增加,达到20μmol/l治疗浓度后应用噻唑蓝(MTT)法研究R-比卡鲁胺对R3327-H和R3327-Rbic两种细胞系的抑制作用,并根据观察结构绘制细胞随药物浓度变化而生成的抑制率曲线。3)应用流式细胞仪研究在R-比卡鲁胺作用下R3327-H和R3327-Rbic两种细胞系所处细胞周期情况。4)应用Transwell实验检测R-比卡鲁胺对R3377-H和R3327-Rhic两种细胞系肿瘤细胞侵袭能力的影响。2、R3327-Rbic细胞对R-比卡鲁胺耐受的机理研究1)应用实时荧光定量核酸扩增检测技术(q-PCR技术)检测R-比卡鲁胺作用后R3327-Rbic细胞系内线粒体的两种重要功能区D-Loop和C02的mtDNA含量的变化。2)应用realtime RT-PCR技术研究雄激素受体(AR)及线粒体呼吸链相关12s,16s核糖体RNA、MT-ND2、MT-ND4和MT-ND6、细胞色素B、ATP6等多肽的mRNA的表达情况。3)应用Illumina Seauencing程序完成对R3327鼠的基因测序,获得的数据加入基因库,对R3327-Rbic细胞进行基因测序,比较基因突变情况。4)weston-blot技术检测R-比卡鲁胺作用于两种细胞增殖整个过程中AR及Drp-1蛋白表达情况,以验证基因测序所得出的结果。3、R-比卡鲁胺耐受的鼠前列腺癌R3327-Rbic模型建立的研究1)应用Martigel等辅助手段在哥本哈根鼠(R3327鼠)体内建立细胞的体内R3327-H和R3327-Rbic两种细胞的成瘤动物模型。2)应用已经成瘤的动物模型分为R3327-H、R3327-Rbic、R3327-H\Rbic、 R3327-Rbic\Rbic四组,来研究R-比卡鲁胺耐受性和非耐受性细胞模型在R-比卡鲁胺作用下肿瘤体积大小3)获得成瘤动物模型瘤体,用原位末端转移酶标记法(TUNEL)比较两种细胞体内凋亡水平的表达差异。研究结果：1、R-比卡鲁胺对前列腺癌细胞R3327-H和R3327-Rbic的作用及R3327-Rbic细胞的特性：1)R-比卡鲁胺作用于R3327-H细胞5天后细胞生长就被明显抑制。这种情况持续了24个周,24个周后细胞又开始复制。可以分离出新的细胞,叫做R3327-Rbic细胞,这种细胞生长速度更快,与R3327-H相比,倍增时间由50小时缩减到25小时。两种细胞都具有典型细胞形态,有特征性的核,清晰可见的核膜,有多个核仁的染色体结构。高倍镜下可以显示后者线粒体形态发生细微的变化,包括管状形态和线粒体嵴增大。2)MTT检验用来分析增加R-比卡鲁胺浓度对R3327-H及R3327-Rbic的影响。生存曲线显示,R3327细胞在0.02 μ mol/l浓度的R-比卡鲁胺溶液中生存率就表现出浓度依赖性的抑制,半数抑制浓度为0.7μmol/l。但是,R-比卡鲁胺对R3327-Rbic细胞的生长影响较小,仅仅在浓度达到20 μ mol/l的情况下曲线才有所下降。这说明治疗剂量下的R-比卡鲁胺对于R3327-Rbic的增殖已经失去调控作用,细胞对药物已经不敏感。3)通过流式细胞仪测定两种细胞周期显示,与对照组相比,R3327-H细胞多处于G1期,比例达到61%,而R3327-Rbic细胞大多数处于S期,比例可达到28%,这表明R-比卡鲁胺可抑制R3327-H组细胞增殖,将细胞周期限制在G1期,而对R3327-Rbic细胞则多数位于增殖活跃的S期,说明R3327-Rbic细胞对R-比卡鲁胺的抑制作用已不再有反应。4) Transwell实验检测穿透膜的细胞数量,这种能力可以反映肿瘤细胞的侵袭能力。通过对两组细胞透膜细胞检测发现在400倍高倍视野下,正常细胞穿膜数为(60.2±6.23)个,R3327-H组细胞为(35.2±7.55)个(p0.05),R3327-Rbic组细胞为(56.2±4.73)个(p0.05)。实验结果说明虽然经过R-比卡鲁胺处理,但R3327-Rbic组细胞的体外侵袭能力未受明显影响,而R3327-H组细胞穿膜能力大大下降,侵袭力明显减弱。2、R3327-Rbic细胞对R-比卡鲁胺耐受的机理研究1)用超螺旋敏感的qPCR方法来观察R-比卡鲁胺对两组细胞mtDNA的含量以及mtDNA相关蛋白表达的影响。结果表明两种细胞和模板mtDNA中D-Loop和C02mtDNA的含量差别不大,均保持在较低水平,这表明R-比卡鲁胺对于两组细胞mtDNA的结构影响微乎其微。但是,在预热模板中检测D-LOOP和C02基因的拷贝数量后可以发现R3327-Rbic组较R3327-H组明显下降,这预示经过R-比卡鲁胺处理后的R3327-Rbic细胞总mtDNA数量是下降的。2)realtime RT-PCR实验对呼吸链复合体的一系列基因进行检测,可以很明确的发现,R3327-Rbic细胞的这些基因的mRNA水平较R3327-H细胞下降的。其中12s基因表达下降最少,而ND6基因表达下降最多。R3327-Rbic细胞的AR基因表达相对R3327-H细胞是1.8,而R3327-H细胞在经过R-比卡鲁胺处理后Drp-1的表达明显增加,超过了R3327-Rbic细胞中的表达,而R-比卡鲁胺对后者中Drp-1的表达几乎没有影响。3)Illu mina基因测序平台检测R3327细胞的线粒体DNA和AR,并将R3327-Rbic细胞的线粒体DNA的基因组检测结果与之比较,观察基因突变情况。结果发现线粒体DNA中ATP6 T8993位点突变,AR中T877A位点突变。4)通过weston-blot方法检测了两种细胞中雄激素受体(AR)水平和Drp-1蛋白表达水平。R3327-Rbic组细胞中AR表达水平较R3327-H组细胞增加,但同时Drp-1水平却较R3327-H组下降。3、R-比卡鲁胺耐受的鼠前列腺癌R3327-Rbic模型建立的研究1)应用两种细胞系背侧种植在哥本哈根鼠(R3327鼠)体内建立细胞的体内R3327-H和R3327-Rbic两种细胞的成瘤动物模型。R3327-H组接种成瘤比例80%(8/10只),R3327-Rbic组接种成瘤比例70%(7/10只)2)研究R-比卡鲁胺耐受性和非耐受性细胞动物模型自然进程和在R-比卡鲁胺作用下瘤体积大小。比较发现,R3327-H组、R3327-Rbic组和R3327-Rbic\Rbic三组之间瘤体大小差别无统计学意义(P0.05),而R3327-H\Rbic组瘤体与前三组相比瘤体明显偏小,差别有统计学意义(P0.05)。3)取出肿瘤标本,用原位末端转移酶标记法(TUNEL)比较两种细胞体内凋亡水平的表达差异。实验结果显示：荧光显微镜下观察经DAPI染色后各标本细胞数量差异无统计学意义。R3327-H组、R3327-Rbic组和R3327-Rbic\Rbic三组细胞凋亡阳性率差别无统计学意义,R3327-H\Rbic组细胞凋亡阳性率明显高于其他三组。研究结论：1、R-比卡鲁胺对前列腺癌细胞R3327-H和R3327-Rbic的体外作用及其相关机理研究发现,经MTT检验和流式细胞仪检测证明R-比卡鲁胺对于R3327-Rbic的增殖已经失去调控作用,细胞对该药物已经不敏感,Transwell实验证明R3327-Rbic的体外侵袭能力基本未受R-比卡鲁胺作用影响。2、RT-PCR研究表明R-比卡鲁胺对于两组细胞mtDNA的结构影响较小,但R3327-Rbic细胞总mtDNA数量是下降的。多种实验方法可以验证R3327-Rbic组细胞中AR表达水平较R3327-H组细胞增加,但同时R3327-H组经比卡鲁胺作用后Drp-1水平却明显上升,具体原因尚待进一步的研究。线粒体DNA中ATP6T8993位点突变,AR中T877A位点突变。证明mtDNA和AR基因突变参与激素非依赖前列腺癌形成过程。3、R-比卡鲁胺耐受的鼠前列腺癌R3327-Rbic模型建立的研究发现,R3327-Rbic细胞可成功建立成瘤动物模型,并且该模型继续保持对R-比卡鲁胺的耐受性,不受该类药物的调控。
【关键词】：前列腺癌 R-比卡鲁胺 R3327细胞 线粒体DNA 雄激素受体
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.25
【目录】：

• 中文摘要6-12
• 英文摘要12-20
• 缩略词说明20-22
• 前言22-29
• 材料和方法29-45
• 结果45-49
• 讨论49-60
• 小结60-61
• 附 图61-72
• 附表72-76
• 综述76-87
• 正文参考文献87-101
• 致谢101-102
• 攻读学位期间发表的学术论文目录102-103
• 学位论文评阅及答辩情况103-104
• 外文论文104-135

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 俞建军;徐月敏;;前列腺组织mtDNA突变对前列腺癌恶性程度的影响[J];临床泌尿外科杂志;2010年08期

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本文编号：887122