国产多孔钽对成骨生物学效应影响机制的体外研究

发布时间：2017-09-20 17:06

  本文关键词：国产多孔钽对成骨生物学效应影响机制的体外研究

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【摘要】：第一章国产多孔钽对兔成骨细胞生物学行为及功能影响的研究目的：通过对国产多孔钽支架材料的物理特性、与成骨细胞复合培养后成骨细胞增殖、细胞周期、成骨性细胞因子分泌功能影响的研究,探讨国产多孔钽支架材料的生物相容性及在修复骨缺损、骨再生中的作用,为进一步体内实验及临床应用提供实验依据。方法：扫描电镜观察国产多孔钽支架材料表面和内部的形貌特征。取新生乳兔颅盖骨成骨细胞进行分离、培养及鉴定,以DMEM为浸提介质根据国标ISO10993-5/ISO 10993-12制备钽浸提液,将多孔钽支架材料高温高压灭菌。随机取第3代成骨细胞分为三组,A组为单纯成骨细胞培养组,B组为多孔钽浸提液与成骨细胞培养组,C组为多孔钽支架材料与成骨细胞复合培养组。CCK-8法检测三组成骨细胞生长增殖情况,检测多孔钽支架材料对细胞毒性及增殖的影响。倒置相差显微镜、扫描电镜、透射电镜观察成骨细胞在多孔钽支架材料上的形态结构,生长、粘附、增殖情况。流式细胞仪检测多孔钽支架材料上生长的成骨细胞的细胞周期。采用ELISA试剂盒,检测三组成骨细胞培养后3、5、7天骨钙素与一型胶原的分泌。结果：国产多孔钽支架材料表面及断面可见针尖大小,分布均匀的蜂窝状孔隙。扫描电镜下观察可见支架材料表面与断面上分布直径20-50μm的微粒,微粒间存在直径400-600μm的孔隙,孔隙间相互连通呈网状,类似于骨松质构架。CCK-8法检测结果：随培养时间的延长,三组成骨细胞生长状态良好,无明显差异,成骨细胞形态正常,贴壁增殖良好,发现各组各时间点的细胞增殖差异均无统计学意义(P0.05)。倒置相差显微镜观察成骨细胞与多孔钽支架材料复合培养可见多孔钽支架材料边缘粘附大量成骨细胞；扫描电镜观察可见成骨细胞在多孔钽支架材料表面及内部孔隙内生长、粘附、增殖,形态多样,细胞相互连接,并分泌大量细胞外基质,基质连接呈片状,逐步覆盖材料；透射电镜观察可见成骨细胞内超微结构大小形态正常,无明显变化。细胞周期检测结果提示三组细胞均为正常二倍体细胞,三组细胞周期分布相似,差异无统计学意义(P0.05)。随机抽取各时间点各组细胞进行分泌功能的检测,结果显示三组细胞均有骨钙素与I型胶原的分泌。结果发现随培养时间延长,细胞骨钙素分泌逐渐增多。多孔钽支架组骨钙素分泌较其他两组升高,差异有统计学意义(P0.05)；钽浸提液组与正常培养液组比较,差异无统计学意义(P0.05)。各组Ⅰ型胶原分泌结果显示实验初期随时间增加I型胶原分泌量增多,5d出现高峰,之后开始下降,同一时间点三组间比较差异无统计学意义(P0.05)；各组组内不同时间点比较,结果显示三组不同时间点比较差异有统计学意义(P0.05)；多重比较显示除多孔钽支架组组内3d和7d无统计学差异(P0.05),其余组间比较均有统计差异(P0.05)。结论：国产多孔钽支架材料具备良好的生物相容性；成骨细胞与多孔钽支架复合培养后骨钙素分泌增多,提示多孔钽支架材料可能促进成骨细胞的矿化及成骨作用。第二章国产多孔钽对成骨因子及成骨转录因子表达影响的研究目的：通过检测成骨细胞与国产多孔钽支架材料复合培养后的成骨因子骨钙素、Ⅰ型胶原、骨桥蛋白、纤维粘连蛋白以及成骨转录因子Runx-2、OSX、P38MAPK的表达变化情况,探讨国产多孔钽支架材料对成骨细胞的成骨效应影响的作用机制,为国产多孔钽支架材料的临床应用提供理论依据。方法：随机取第3代成骨细胞分为三组,A组为单纯成骨细胞培养组(正常培养液组),B组为多孔钽浸提液与成骨细胞培养组,C组为多孔钽支架材料与成骨细胞复合培养组。分别取培养5d的三组细胞进行细胞爬片,采用免疫细胞化学染色法测定成骨因子Col-1、OC、FN、OPN及成骨转录因子Runx-2、OSX、 P38MAPK的表达情况；并对多孔钽支架组细胞进行免疫细胞荧光化学染色法检测成骨因子OPN与成骨转录因子Runx-2、OSX, P38 MAPK与Runx-2、OSX的共表达情况。分别提取培养5d的三组细胞的蛋白及RNA分别采用免疫细胞蛋白印迹法及实时荧光定量PCR法检测Col-1、OC、FN、OPN及Runx-2、 OSX、 P38MAPK蛋白及mRNA表达情况。结果：免疫细胞化学染色检测培养5d的各组细胞成骨因子表达情况发现,在正常培养液组、钽浸提液组及多孔钽支架组均存在OC、Col-1、FN、OPN、 Runx-2、OSX、p-P38(磷酸化的P38)的阳性细胞的表达,细胞胞浆内可见棕黄色颗粒,多孔钽支架组各因子的表达均较其他两组有升高趋势,尤其是OC、OPN、 Runx-2、OSX的表达较其他两组显著升高,差异有统计学意义(P0.05)。免疫荧光细胞化学染色发现多孔钽支架组存在Runx-2、OSX分别与OPN共表达情况,通过荧光染剂标记Funx-2、OSX在细胞胞浆内呈绿色,OPN呈红色,多孔钽支架组的成骨细胞中存在Ri nx-2、OSX分别与OPN共表达的情况,胞浆呈黄绿色；同时还可见p-P38荧光染色为红色,同时分别标记Runx-2、OSX绿色后可与p-P38荧光双标,发现还存在p-P38分别与Runx-2、OSX的共表达,胞浆呈黄绿色的情况。免疫细胞蛋白印迹结果发现三组细胞各因子蛋白表达情况与免疫细胞化学染色结果基本一致,三组均存在OC、Col-1、FN、OPN、Runx-2、OSX、p-P38的蛋白表达,多孔钽支架组OC、OPN、Runx-2、OSX蛋白表达显著升高,差异有统计学意义(P0.05)；实时荧光定量PCR技术检测导各组均存在OC、Col-1、 FN、OPN、Runx-2、OSX、p-P38 mRNA的表达,多孔钽支架组OC、OPN、Runx-2、OSX基因相对表达量显著上调,与其他两组比较差异有统计学意义(P0.05)。结论：国产多孔钽支架材料可通过影响成骨转录因子Runx-2、OSX的表达,影响成骨因子Col-1、OPN、OC、FN表达最终促进成骨细胞增殖、生长与矿化,促进成骨,是较理想的骨移植替代材料。第三章国产多孔钽与成骨细胞相互作用机制的蛋白质组学研究目的：采用以同位素相对标记与绝对定量技术(iTRAQ)的蛋白质组学技术分析MG63细胞在正常培养液、钽浸提液以及多孔钽支架材料,三种不同的培养环境下蛋白表达的改变,查找并探讨分析多孔钽支架材料的三维立体结构对成骨细胞影响的相关因子及其作用机制,同时对前期工作进行印证。方法：取生长状态良好的第3代MG63细胞,随机分为三组,A组为正常培养液组,B组为钽浸提液组,C组为多孔钽支架材料组。每组接种相同数量的MG63细胞。A组MG63细胞采用MEM培养液培养；B组MG63细胞采用钽浸提液培养;C组取高温高压灭菌的多孔钽支架材料,MEM培养液浸润后将MG63细胞悬液滴到多孔钽支架材料表面,在37℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱内静置培养2h,将材料翻转,滴加MG63细胞悬液25μl于材料的另一面,在37℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱内静置培养2h,将支架材料移入一新孔内,加入MEM培养液继续培养。三组培养板于37℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱内培养,每2d更换1次培养液,连续培养7天。CCK-8法检测细胞增值情况。扫描电镜观察多孔钽支架上细胞生长状态。提取各组细胞蛋白,采用Bradford法蛋白定量,提取部分蛋白进行双向荧光凝胶差异电泳,检查蛋白提取及定量情况以及三样本间差异状况,初步分析蛋白样本情况。采用iTRAQ试剂将A、B、C组剩余细胞蛋白样品标记,酶解肽段离线预分离,LC-MS/MS质谱分析,经过强阳离子交换、反相液相色谱分离后采用ABI-5600质谱进行质谱分析,对质谱数据进行分析,对蛋白进行检测和鉴定,将差异蛋白筛选完成。通过总体差异蛋白的处理,筛选参与影响成骨细胞的差异蛋白。对差异蛋白定量信息统计,对数据的生物信息解析。对差异蛋白进行分子功能、亚细胞定位、参与的生物过程的GO分析,寻找与差异蛋白显著相关的生物学功能,完成蛋白质之间的相互作用的分析,探讨多孔钽支架材料组与钽浸提液组以及正常培养液组差异蛋白参与的主要的生物代谢途径和信号转导通路。结果：MG63细胞在正常培养液、钽浸提液以及多孔钽支架材料三种环境下培养,细胞生长状态良好,细胞形态单一化,呈多角形或长梭形；ALP染色结果阳性。经析因方差分析不同时间下正常培养液组、钽浸提液组和多孔钽支架组CCK-8法检测细胞活性OD值的结果。组间OD值差异无显著性意义(F=2.141,P=0.124)。不同时间间差异有显著性意义(F=2302.523,P0.001)。分组和时间之间存在交互作用(F=4.661,P0.001)。单独效应：固定时间进行组间比较,结果显示除7d外其余时间三组间比较差异无统计学意义(P0.05)。扫描电镜观察,多孔钽支架材料组细胞在材料表面以及材料孔隙间粘附生长,初期细胞排列较稀疏；随时间增加相邻细胞互相连接,逐步覆盖大部分材料表面,并延伸入孔隙当中；后期细胞分泌大量基质,逐步覆盖材料表面。提取三组细胞蛋白进行定量分析,凝胶电泳结果提示三组样本条带清晰、多根、分布均匀、无明显高丰度,符合进行试验的标准。双向荧光差异电泳发现三样本间存在明显的差异点,达到iTRAQ试验的标准。iTRAQ实验结果根据原始数据的p-value,选取p≤0.05进行过滤后,差异倍数≥1.5或差异倍数≤0.666,所得结果进入分析,鉴定到钽浸提液组与正常培养液组比较差异蛋白有56个；多孔钽支架材料组与正常培养液组比较差异蛋白有150个。将差异蛋白数据Map到DAVID的数据库中,钽浸提液组与正常培养液组比较差异,有6个不能识别,数据库识别有记录信息的有50个,其中上调蛋白35个,下调蛋白15个,开展GO功能注释,通过对差异蛋白参与的生物学过程、具备的分子功能以及蛋白质所属细胞成分的分析,筛选出与本实验相关的差异蛋白上调蛋白6个,下调蛋白2个；多孔钽支架材料组与正常培养液组差异比较蛋白,有26个不能识别,数据库识别有记录信息的有124个,其中上调蛋白104个,下调蛋白20个,开展GO功能注释,通过对差异蛋白参与的生物学过程、具备的分子功能以及蛋白质所属细胞成分的分析,筛选出与本实验相关的差异蛋白上调蛋白12个,下调蛋白1个。同时发现驱动蛋白-1,肌动蛋白,角蛋白10具有一致性差异表达；多孔钽支架材料组出现细胞骨架相关蛋白,凝溶胶,过氧化氢酶,磷脂酶A2,整合素β-1,钙结合蛋白A4,细胞外基质蛋白-1的差异上调。结论：经过同位素相对标记与绝对定量技术(iTRAQ),筛选出多孔钽支架组与钽浸提液组以及正常培养液组的差异蛋白,验证前期工作的同时,揭示多孔钽材料与细胞相互作用机制,前期工作提示细胞在多孔钽的三维立体结构上细胞增殖,粘附能力增强,细胞基质分泌增多,通过蛋白组学技术分析多孔钽支架材料组出现的大部分差异蛋白主要参与细胞粘附、运动、分泌过程,说明多孔钽的三维立体空间结构、高孔隙率和内部微孔结构可增强细胞粘附、分泌的能力,进一步为国产多孔钽支架材料的研究提供理论基础和新的研究方向。
【关键词】：国产多孔钽支架材料 细胞毒性 生物相容性 成骨细胞 细胞外基质 国产多孔钽支架 骨钙素 骨桥蛋白 Runx-2 OSX 国产多孔钽 支架材料 蛋白质组学 iTRAQ
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R68;R318.08
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-19
• 前言19-26
• 参考文献22-26
• 第一章 国产多孔钽对兔成骨细胞生物学行为及功能影响的研究26-58
• 1.1 仪器与试剂27-29
• 1.2 实验方法29-34
• 1.3 试验结果34-49
• 1.4 讨论49-53
• 1.5 参考文献53-58
• 第二章 国产多孔钽对成骨因子及成骨相关因子表达影响的研究58-93
• 2.1 仪器与试剂60-62
• 2.2 实验方法62-68
• 2.3 实验结果68-84
• 2.4 讨论84-88
• 2.5 参考文献88-93
• 第三章 国产多孔钽与成骨细胞相互作用机制的蛋白质组学研究93-131
• 3.1 仪器与试剂95-99
• 3.2 实验方法99-105
• 3.3 实验结果105-119
• 3.4 讨论119-125
• 3.5 参考文献125-131
• 小结131-132
• 本课题创新点131
• 本课题不足点131-132
• 成果132-133
• 致谢133-135
• 统计学证明135

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本文编号：889303