miRNA-155介导ESAT-6诱导巨噬细胞凋亡的分子机制及其在结核诊断中的作用

发布时间：2017-09-27 03:05

  本文关键词：miRNA-155介导ESAT-6诱导巨噬细胞凋亡的分子机制及其在结核诊断中的作用

  更多相关文章： 凋亡 早期分泌抗原6 微小RNA-155 核转录因子-κB 细胞因子信号抑制因子-1 Toll样受体-2 结核病

【摘要】：研究背景:结核感染仍是世界公共卫生难题,据2014年世界卫生组织(World Health Organization,WHO)统计:2013年约有900万新增活动型结核病人,其中高达150万人因结核病而丧命。近年来随着多重耐药结核、广泛性耐药结核病的出现以及HIV-TB的合并感染,更加剧了目前结核病防控的严峻形势。结核病的主要致病菌为结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb),其主要潜伏感染人巨噬细胞,并引起宿主细胞坏死裂解。抗结核免疫应答是机体清除结核分枝杆菌的重要环节。除作为Mtb的主要感染细胞,巨噬细胞同样也是机体杀死结核分枝杆菌的重要效应细胞。已有研究表明:细胞凋亡在机体抗结核固有免疫应答中发挥重要作用,Mtb减毒株或无毒株可促进细胞凋亡发生,控制结核感染;然而Mtb强毒株可抑制凋亡并诱导细胞坏死,引起结核扩散。结核早期分泌抗原ESAT-6,作为结核分枝杆菌的重要毒力因子,在免疫调节中亦发挥重要作用。已有研究显示:结核早期分泌抗原ESAT-6能够促进巨噬细胞凋亡,有利于机体清除结核分枝杆菌,但其相关分子机制并不十分清楚。在前期预实验中,我们发现:ESAT-6抗原刺激巨噬细胞后,能引起胞内mi R-155表达显著升高,相关研究报道mi R-155参与了卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)介导的巨噬细胞凋亡,通过生物信息学预测分析,我们发现细胞信号抑制分子-1(suppressor of cytokine signaling-1,SOCS1)是mi R-155的一个重要靶基因,且已有证据表明SOCS1可能是Mtb感染时巨噬细胞中调节细胞因子信号通路的一个关键分子,由此,我们推测mi R-155与SOCS1相互作用可能参与了结核早期分泌抗原ESAT-6介导的巨噬细胞凋亡过程。本研究拟在已有研究报道和我们前期工作基础上开展如下工作:(1)明确结核抗原ESAT6处理巨噬细胞后,巨噬细胞内mi R-155、SOCS1的动态变化和时间特异性;(2)应用慢病毒转染控制mi R-155及SOCS1表达,探讨ESAT-6处理后,巨噬细胞中凋亡分子Caspase-3表达情况,明确mi R-155及SOCS1在巨噬细胞凋亡中的作用;同时采用si RNA干扰技术控制Toll样受体2(Toll-like receptor 2,TLR2)及NF-κB p65表达,初步探讨ESAT-6诱导mi R-155表达上调的原因;(3)收集人外周血单个核细胞,荧光定量PCR检测特定免疫分子及细胞因子表达情况,探讨其在结核诊断中的作用。本研究力图为阐明ESAT-6在宿主免疫调节中的作用提供新的理论依据,同时亦为寻找新的结核病干预靶点及临床结核病诊治提供新的思路。方法:1.应用结核早期分泌抗原ESAT-6处理巨噬细胞系RAW264.7,收集经处理后不同时间点细胞总RNA及蛋白,实时荧光定量PCR技术检测胞内mi R-155、BIC、SOCS1、IL6及TNF-α及IFN-γ等m RNA表达水平;Western-blot技术检测SOCS1、NF-κB p65及凋亡分子Caspase-3蛋白表达水平;同时,采用流式细胞仪检测不同时间点细胞凋亡发生情况;2.采用慢病毒过表达mi R-155及抑制mi R-155,实时荧光定量PCR技术检测胞内SOCS1、IL6及TNF-αm RNA表达变化;Western-blot技术检测SOCS1及凋亡分子Caspase-3蛋白表达水平变化;并用流式细胞仪分析抑制mi R-155后对细胞凋亡的影响;3.采用慢病毒过表达SOCS1基因,Western-blot技术检测凋亡分子Caspase-3蛋白表达水平;同时在过表达SOCS1的条件下,Western-blot技术及流式细胞术观察mi R-155对巨噬细胞凋亡的影响;4.为了进一步弄清楚ESAT-6诱导mi R-155表达上调的主要原因,我们采用了si RNA干扰技术,控制RAW264.7细胞内TLR2及NF-κB p65的表达,并用Western-blot技术观察TLR2及NF-κB p65干扰效果,以及实时荧光定量PCR技术检测细胞内mi R-155表达水平;5.将研究人群分为三个组:正常对照组、活动型结核组及潜伏型结核组。收集人外周血单个核细胞,提取总RNA,采用实时荧光定量PCR技术检测特定免疫分子(TLR2、BIC、mi R-155、SOCS1)及细胞因子(TNFα、IL6、IL12p40、i NOS、IFN-γ)m RNA表达水平。结果:1.ESAT-6处理巨噬细胞24h内,细胞凋亡分子活性Caspase-3表达不断增加;流式细胞检测结果亦表明ESAT-6能够显著促进巨噬细胞凋亡发生,并有时间依赖效应;此外,研究结果显示mi R-155、BIC及相关细胞因子m RNA表达水平随ESAT-6处理时间不断增加,而SOCS1表达水平随时间增加而不断下降;2.单独过表达mi R-155能显著抑制SOCS1表达,提高巨噬细胞凋亡分子Cleaved Caspase-3表达,并促进巨噬细胞凋亡发生。采用慢病毒抑制mi R-155表达,巨噬细胞内SOCS1表达明显升高,而细胞因子如IL6,TNF-α等表达显著减少,细胞凋亡受到明显抑制;3.过表达SOCS1基因可抑制ESAT-6介导的巨噬细胞凋亡;而在过表达SOCS1条件下,过表达mi R-155则可恢复Cleaved Caspase-3表达及大部分巨噬细胞凋亡的发生。4.成功构建TLR2及NF-κB p65-si RNA干扰细胞系,结果发现抑制TLR2表达能显著降低ESAT-6介导的NF-κB p65表达,并干扰细胞内mi R-155的表达,提示TLR2/NF-κB活化可能是ESAT-6诱导mi R-155表达上调的主要原因。5.Q-PCR检测人外周血单个核细胞中特定免疫调节分子(TLR2,BIC,mi R-155及SOCS1)和细胞因子结果表明:TLR2,BIC,mi R-155以及SOCS1在各组别中差异表达,进一步统计分析提示mi R-155/SOCS1比值可能区分活动型结核及潜伏型结核感染。结论:1.mi R-155在ESAT-6介导的巨噬细胞免疫活化及凋亡过程中具有重要作用;2.mi R-155可能通过靶向作用SOCS1参与调控结核早期分泌抗原ESAT-6介导的巨噬细胞凋亡发生;3.ESAT-6诱导的mi R-155表达上调与巨噬细胞内TLR2/NF-κB活化相关;4.TLR2,BIC,mi R-155以及SOCS1或可作为结核病诊断的新型生物标记分子。综上所述,TLR2/NF-κB/mi R-155/SOCS1信号参与了ESAT-6介导的巨噬细胞凋亡过程,mi R-155在ESAT-6介导的巨噬细胞免疫反应中发挥重要作用,这可能揭示了结核早期分泌抗原ESAT-6在宿主免疫调节作用中的新机制。同时,本研究提示TLR2/NF-κB/mi R-155/SOCS1或可作为宿主免疫调节治疗的重要靶标,为结核治疗研究增添了新的内容;此外,人群研究提示TLR2,BIC,mi R-155及SOCS1或可作为活动型结核及潜伏型结核诊断的重要指标,为结核病的诊断可能提供了新的思路。
【关键词】：凋亡 早期分泌抗原6 微小RNA-155 核转录因子-κB 细胞因子信号抑制因子-1 Toll样受体-2 结核病
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R52
【目录】：

• 英文缩写一览表4-7
• 英文摘要7-12
• 中文摘要12-15
• 第一章 前言15-23
• 1.1 选题缘由15-16
• 1.2 研究背景16-22
• 1.3 研究意义22-23
• 第二章 miRNA-155靶向作用SOCS1基因调控结核早期分泌抗原ESAT-6 介导的巨噬细胞凋亡23-53
• 2.1 材料与方法24-40
• 2.2 结果40-50
• 2.3 讨论50-53
• 第三章 miRNA-155及SOCS1的表达在活动型结核及潜伏型结核诊断中的作用53-65
• 3.1 材料与方法54-59
• 3.2 结果59-62
• 3.3 讨论62-65
• 全文总结65-66
• 本研究的创新之处66-67
• 参考文献67-79
• 文献综述 抗结核病治疗研究进展79-105
• 参考文献93-105
• 附录105-107
• 攻读学位期间的研究成果107-108
• 致谢108

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 ;豚鼠巨噬细胞经P_(204)处理后的抗石英细胞毒作用[J];国外医学参考资料(卫生学分册);1976年04期

2 邓侠进;;巨噬细胞的抗癌作用[J];遵义医学院学报;1979年02期

3 陆天才;;疾病对肺巨噬细胞的影响[J];煤矿医学;1982年01期

4 郭瑞清;祝彼得;;一种分离巨噬细胞的简单方法[J];滨州医学院学报;1990年02期

5 谢志坚;巨噬细胞异质性[J];医学综述;2001年06期

6 饶艳;运动及神经内分泌对巨噬细胞功能的调节[J];体育与科学;2002年05期

7 朱金元;;吸烟对肺巨噬细胞的影响[J];浙江医学教育;2003年01期

8 张俊峰;过氧化物酶体增殖物激活受体与单核/巨噬细胞系[J];医学综述;2004年03期

9 韦锦学;顾军;;巨噬细胞的激活诱导死亡[J];生命科学;2006年02期

10 李晓曦;郭宁;曹雪涛;;肿瘤相关巨噬细胞促进肿瘤生长与转移的研究现状[J];中国肿瘤生物治疗杂志;2008年01期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 史玉玲;王又明;丰美福;;巨噬细胞激活作用的研究[A];中国细胞生物学学会第五次会议论文摘要汇编[C];1992年

2 吴国明;周辉;;巨噬细胞和创伤纤维化[A];2009年浙江省骨科学学术年会论文汇编[C];2009年

3 李奇;王海杰;;透明质酸对于淋巴结巨噬细胞运动的影响[A];解剖学杂志——中国解剖学会2002年年会文摘汇编[C];2002年

4 刘革修;欧大明;刘军花;黄红林;廖端芳;;丙丁酚在体外能抑制巨噬细胞脂质氧化介导的低密度脂蛋白氧化并调节氧化巨噬细胞的分泌功能[A];面向21世纪的科技进步与社会经济发展（下册）[C];1999年

5 叶金善;杨丽霞;郭瑞威;;环氧化酶-2/前列腺素E_2在血管紧张素Ⅱ刺激巨噬细胞表达细胞外基质金属蛋白酶诱导因子中的作用[A];第十三次全国心血管病学术会议论文集[C];2011年

6 秦帅;陈希;孔德明;;构建由绿色荧光标记巨噬细胞的转基因斑马鱼系[A];贵州省中西医结合内分泌代谢学术会论文汇编[C];2012年

7 武剑华;徐惠绵;;肿瘤相关巨噬细胞在胃癌中的相关研究[A];第9届全国胃癌学术会议暨第二届阳光长城肿瘤学术会议论文汇编[C];2014年

8 何军;;血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体升高巨噬细胞内胆固醇水平[A];中华医学会第11次心血管病学术会议论文摘要集[C];2009年

9 宋盛;周非凡;邢达;;PDT诱导的凋亡细胞对巨噬细胞NO合成的影响[A];第七届全国光生物学学术会议论文摘要集[C];2010年

10 张磊;朱建华;黄元伟;姚航平;;血管紧张素Ⅱ对巨噬细胞(THP-1重细胞)凝集素样氧化低密度脂蛋白受体表达的影响[A];浙江省免疫学会第五次学术研讨会论文汇编[C];2004年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 通讯员 李静 记者 胡德荣;恶性肿瘤巨噬细胞未必皆“恶人”[N];健康报;2014年

2 兰克;以尝试用巨噬细胞治瘫痪[N];科技日报;2000年

3 薛佳;免疫系统——人体的“卫士”[N];保健时报;2009年

4 记者 胡德荣;铁泵蛋白“维稳”铁代谢作用首次阐明[N];健康报;2011年

5 侯嘉 何新乡;硒的神奇功能[N];中国食品质量报;2003年

6 唐颖 倪兵 陈代杰;巨噬细胞泡沫化抑制剂研究快步进行[N];中国医药报;2006年

7 刘元江;新发现解释肿瘤为何易成“漏网之鱼”[N];医药经济报;2007年

8 本报记者 侯嘉 通讯员 何新乡;今天你补硒了吗[N];医药经济报;2003年

9 左志刚;升血小板药使用注意[N];医药养生保健报;2007年

10 记者 许琦敏;“铁泵”蛋白帮助回收铁元素[N];文汇报;2011年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 周赤燕;巨噬细胞MsrA对动脉粥样硬化的干预研究[D];武汉大学;2013年

2 章桂忠;TIPE2蛋白调控细胞增殖和炎症的机制研究[D];山东大学;2015年

3 张瑜;DKK1抑制巨噬细胞内脂质沉积及其相关分子机制[D];山东大学;2015年

4 孟涛;异丙酚对心脏收缩功能的抑制作用及其对巨噬细胞分泌功能调节的机制研究[D];山东大学;2015年

5 周兴;基于酵母微囊构建新型口服巨噬细胞靶向递送系统的研究[D];第三军医大学;2015年

6 蒋兴伟;Tim-3对巨噬细胞极化的调控机制研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2015年

7 刘伯玉;清道夫受体A介导小鼠巨噬细胞吞噬钩端螺旋体研究[D];上海交通大学;2013年

8 杨绍俊;miRNA-155介导ESAT-6诱导巨噬细胞凋亡的分子机制及其在结核诊断中的作用[D];第三军医大学;2015年

9 翟光耀;单核/巨噬细胞Ly6C~(low)亚群在心肌梗死后瘢痕形成期的抗炎特性研究[D];北京协和医学院;2014年

10 韩露;TRB3介导的脂肪组织巨噬细胞极化与糖尿病冠状动脉病变关系的研究[D];山东大学;2015年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 马春梅;AP0E~(-/-)小鼠TLR9介导巨噬细胞极化效应对动脉粥样硬化作用的研究[D];福建医科大学;2015年

2 张译丹;盐皮质激素受体拮抗剂调控巨噬细胞表型对实验性矽肺的作用[D];河北医科大学;2015年

3 卢文冉;HCV core蛋白作用的巨噬细胞培养上清对肝细胞生物学性状的影响[D];河北医科大学;2015年

4 李文建;载脂蛋白E影响巨噬细胞因子表达及分型的机制研究[D];河北医科大学;2015年

5 曹爽;高糖对巨噬细胞TLR4信号转导的调节作用[D];河北医科大学;2015年

6 宁程程;肿瘤相关巨噬细胞在子宫内膜癌雌激素敏感性中的作用及机制研究[D];复旦大学;2014年

7 高龙;PLD4在肿瘤相关巨噬细胞抑制结肠癌增殖中的作用研究[D];成都医学院;2015年

8 任虹;感染期子宫颈癌U14细胞荷瘤小鼠抑制巨噬细胞CCL5分泌的机制研究[D];河北医科大学;2015年

9 李美玲;双酚A对小鼠腹腔巨噬细胞极化影响的体外研究[D];安徽医科大学;2015年

10 刘琼;黄芪多糖影响巨噬细胞向脂肪细胞趋化的作用及机制研究[D];新乡医学院;2015年

，

本文编号：927248