鸡IFIT5基因的克

发布时间：2017-10-09 19:12

  本文关键词：鸡IFIT5基因的克隆、表达及其抗病毒功能研究

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【摘要】：IFIT家族是一类主要受干扰素、病毒和脂多糖诱导表达的干扰素诱导基因。其编码的蛋白可通过抑制翻译起始,识别、结合并隐退特定类型的病毒核酸或蛋白以及参与调节细胞固有的和非固有的免疫反应等方式来抵抗病毒的入侵。然而,目前该家族基因在禽类上的研究甚少。本研究首先通过分子克隆的方法获取了鸡IFIT5基因CDS区全长序列,并对其相关分子生物信息进行了分析与预测。其次,采用qRT-PCR技术构建了鸡IFIT5基因的组织表达谱,并在机体和细胞水平上检测了鸡IFIT5基因对不同毒力新城疫病毒毒株和不同诱导刺激物的免疫应答差异。最后,在细胞水平上采用siRNA干扰和外源过表达技术初步探究了鸡MDA-5、LGP-2、MAVS和IRF-3对IFIT5基因的表达调控作用以及鸡IFIT5基因对IRF-3和NF-κB信号通路的影响。取得的主要结果如下：(1)鸡IFIT5基因CDS区全序列长1440bp,由两个外显子组成,共可编码479个氨基酸。其推导氨基酸序列与鸟类对应序列的相似度均不超过70%,与哺乳动物对应序列的相似度均不超过50%。(2)鸡IFIT5基因在脾、心、肺、胸腺、肾和小肠组织中具有相对较高的mRNA表达丰度,在法氏囊、脑、胸肌和腿肌组织中具有相对较低的mRNA表达丰度,而在肝脏组织中几乎不表达。(3)鸡IFIT5基因在两攻毒组鸡只的胸腺和脾脏组织中的表达量变化均呈先上升后下降的趋势且在第二天达到峰值,在Mukteswar攻毒鸡只的法氏囊组织中呈先上升后下降的趋势且在第一天达到峰值,在F48E9攻毒鸡只的法氏囊组织中则呈持续上升趋势。(4)鸡IFIT5和IFN-β基因在转染poly I:C和poly dA:dT 4 h后表达水平显著上调。(5)鸡IFIT5和IFN-P基因在感染Mukteswar毒株后存在明显协同表达关系,且在8h后的二次感染过程中鸡IFIT5基因的表达量相对于IFN-β基因呈现出明显的延后上调。(6)过表达鸡MDA、MAVS和IRF-3基因可显著增强鸡IFIT5基因的免疫应答水平,而干扰鸡MDA-5、LGP-2、MAVS和IRF-3基因可显著抑制鸡IFIT5基因的免疫应答水平。(7)过表达鸡IFIT5基因可显著增强IRF-3和NF-κB应答基因的免疫应答水平。上述结果表明：鸡IFIT5基因在非刺激状态下的表达分布具有明显的组织特异性,在受到RNA病毒或DNA病毒刺激时表达量会明显上调,且其表达水平会受到鸡MDA-5、LGP-2、MAVS和IRF-3蛋白的调控。此外,鸡IFIT5蛋白对IRF-3和NF-κB信号通路具有正向调控作用。
【关键词】：鸡 IFIT5 克隆 表达 新城疫病毒
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S831
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 主要符号说明9-12
• 1 文献综述12-27
• 1.1 IFIT家族简介12-13
• 1.2 IFIT家族基因结构与表达研究进展13-18
• 1.2.1 IFIT家族基因结构特征13
• 1.2.2 IFIT家族基因表达特性13-14
• 1.2.3 IFIT家族基因表达调控通路14-18
• 1.3 IFIT家族蛋白结构与功能研究进展18-23
• 1.3.1 IFIT家族蛋白结构特征18-19
• 1.3.2 IFIT家族蛋白功能研究19-23
• 1.4 IFIT5的研究进展23-26
• 1.5 研究目的及意义26-27
• 2 材料与方法27-40
• 2.1 试验材料27-30
• 2.1.1 试验动物与病毒来源27
• 2.1.2 主要仪器设备27-28
• 2.1.3 主要试剂及耗材28-29
• 2.1.4 主要分析软件及网站29-30
• 2.2 试验方法30-40
• 2.2.1 试验技术路线30
• 2.2.2 SPF鸡的孵化、饲喂、攻毒和采样30
• 2.2.3 cDNA模板的制备30-32
• 2.2.4 鸡IFIT5基因CDS区的克隆与测序32-35
• 2.2.5 真核表达载体的构建35-36
• 2.2.6 细胞试验36-37
• 2.2.7 实时荧光定量PCR37-39
• 2.2.8 数据统计与分析39-40
• 3 结果与分析40-57
• 3.1 鸡IFIT5基因CDS区的克隆与测序40
• 3.2 鸡IFIT5基因CDS区序列分析40-45
• 3.2.1 鸡IFIT5基因CDS区核苷酸序列分析40-42
• 3.2.2 鸡IFIT5基因推导氨基酸序列分析42-45
• 3.3 鸡IFIT5基因mRNA水平的组织表达谱构建45-46
• 3.4 鸡IFIT5基因在机体中对不同毒力新城疫病毒的免疫应答差异46-49
• 3.4.1 两攻毒组胸腺组织中IFIT5基因的表达差异46-47
• 3.4.2 两攻毒组脾脏组织中IFIT5基因的表达差异47
• 3.4.3 两攻毒组法氏囊组织中IFIT5基因的表达差异47-49
• 3.5 鸡IFIT5基因在鸡胚成纤维细胞中对不同刺激物的免疫应答差异49-51
• 3.5.1 Poly I：C对鸡IFIT5基因的免疫诱导作用49
• 3.5.2 Poly dA：dT对鸡IFIT5基因的免疫诱导作用49
• 3.5.3 新城疫病毒Mukteswar毒株对鸡IFIT5基因的免疫诱导作用49-51
• 3.6 鸡MDA-5、LGP-2、MAVS和IRF-3基因对IFIT5表达水平的调控作用51-53
• 3.6.1 过表达鸡MDA-5、LGP-2、MAVS和IRF-3基因对IFIT5免疫应答水平的影响51
• 3.6.2 干扰鸡MDA-5、LGP-2、MAVS和IRF-3基因表达对IFIT5免疫应答水平的影响51-53
• 3.7 鸡IFIT5蛋白的亚细胞定位53
• 3.8 过表达鸡IFIT5基因对IRF-3和NF-κB应答基因表达水平的影响53-57
• 4 讨论57-62
• 4.1 鸡IFIT5基因CDS区序列分析57
• 4.2 鸡IFIT5基因的组织表达分布特点57-58
• 4.3 两攻毒组中IFIT5基因的免疫应答差异58-59
• 4.4 鸡胚成纤维细胞对不同刺激物的免疫应答差异59-60
• 4.5 鸡MDA-5、LGP-2、MAVS和IRF-3对IFIT5基因的表达调控60
• 4.6 鸡IFIT5对IRF-3和NF-κB信号通路的影响60-62
• 5 结论62-64
• 参考文献64-70
• 致谢70-72
• 攻读学位期间发表的学术论文72

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1 杨辉林;鸡IFIT5基因的克隆、表达及其抗病毒功能研究[D];四川农业大学;2015年

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本文编号：1001906