MDC细胞蛋白双抗体夹心ELISA检测方法的建立

发布时间：2017-12-08 07:17

  本文关键词：MDC细胞蛋白双抗体夹心ELISA检测方法的建立

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【摘要】：MDCK细胞(Madin-Darby canine kidney cells)是从一只正常成年可卡犬的肾脏中分离出来的贴壁型细胞。MDCK细胞对腺病毒、犬细小病毒、呼肠孤病毒、禽流感病毒等多种病毒都比较敏感,而且细胞容易大规模培养,增殖快,流感病毒感染效率高,可产生高滴度,所以MDCK细胞被纳入生产甲型流感疫苗和乙型流感疫苗的细胞系之一。疫苗中残留的宿主细胞蛋白会对机体产生毒害作用,可能会引起过敏反应。为了保证疫苗产品的安全有效,中国药典限定了宿主细胞蛋白的残留量,本研究对疫苗中残留的MDCK细胞蛋白检测方法进行了初步的探索。先用MDCK细胞制备了蛋白含量为5.03mg/mL的MDCK细胞蛋白抗原,选用低剂量抗原短程免疫法免疫家兔、豚鼠、鸡和羊四种动物,获得多克隆抗体。由于豚鼠血和鸡血中MDCK抗体水平均过低,所以选用兔抗MDCK和羊抗MDCK多克隆抗体进行双抗体夹心ELISA方法的建立。然后用间接ELISA方法测定制备的抗体效价,兔血中MDCK抗体水平为1:10000;羊血中MDCK抗体水平为1:1000。双向琼脂免疫扩散实验测定制备的兔抗MDCK多克隆抗体效价为1:32,羊抗MDCK多克隆抗体效价为1:8。经western blot分析,制备的兔抗MDCK和羊抗MDCK多克隆抗体与胎牛血清、新生牛血清、马血清均没有出现交叉反应,本试验制备获得的多克隆抗体具有良好的特异性。用纯化的羊抗MDCK多克隆抗体作为包被抗体,用改良过碘酸钠法标记的兔抗MDCK多克隆抗体作为酶标抗体,建立检测MDCK细胞蛋白双抗体夹心ELISA方法,经过对各反应条件的优化,最终得到最优条件:羊抗MDCK抗体最佳包被浓度为1Oμg/mL,含10%马血清的PBST液为最佳封闭液,酶标兔抗MDCK抗体最佳稀释度为1:2000。MDCK细胞蛋白含量在2.5-40μg/mL范围内线性关系较好,最低检测值为2.5μg/mL。对该方法的质量评价验证结果表明,建立的双抗体夹心ELISA方法特异性、稳定性和重复性好。用建立的双抗体夹心ELISA方法对基于MDCK细胞生产的重组禽流感病毒三价灭活疫苗(细胞源,Re-6株+Re-7株+Re-8株)进行检测,均能检出残留蛋白。目前,《中国药典》还未有关于疫苗中MDCK细胞蛋白残留量的相关规定,本研究建立的双抗体夹心ELISA定量检测方法,为基于MDCK细胞生产人用及兽用疫苗过程监测及产品检测奠定了基础,为提高疫苗的质量,降低市场风险提供了保障。
【学位授予单位】：西北民族大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.4

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本文编号：1265511