Bta-miR-224调控奶牛乳腺上皮细胞TG生成和凋亡机制的研究

发布时间：2017-12-09 04:02

  本文关键词：Bta-miR-224调控奶牛乳腺上皮细胞TG生成和凋亡机制的研究

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【摘要】：miRNAs是一类非编码的小RNA,能够通过靶向对应的靶基因,进行转录和翻译水平的调控,以便调控人类、动物和植物的生长发育、细胞凋亡以及癌症的发生等生物学过程。与mi R-224相关的研究多数集中在疾病的研究中,研究表明mi R-224参与细胞的增殖和凋亡等生物过程,与癌症的发生密切相关。最近,研究人员发现mi R-224参与小鼠脂肪细胞的分化,调控猪脂肪的形成和沉积等,都说明mi R-224在脂质代谢中发挥着重要的作用。但是,bta-miR-224对奶牛乳脂代谢调控机制尚不明确。因此本研究旨在通过验证bta-miR-224与脂质代谢相关的新的靶基因,并对bta-miR-224的生物学功能进行验证。为深入了解bta-miR-224在乳脂代谢调节中的作用提供依据,从而为生产实践提供一定的理论基础和指导。本实验第一步利用生物信息学网站预测出bta-miR-224可能的靶基因ACADM和ALDH2。接下来用双荧光素酶报告系统来验证bta-miR-224与ACADM、ALDH2基因之间的识别位点,结果显示,共转染bta-miR-224 mimics和ACADM 3’UTR野生型序列后的细胞荧光活性显著低于共转染了bta-miR-224 mimics和ACADM突变型载体序列后的细胞的荧光活性(p0.05),共转染了bta-miR-224 mimics和ACADM突变型载体组与共转染了bta-miR-224 mimics和空载载体组相比,细胞荧光活性无显著性差异(p0.05)。ALDH2基因的表达趋势相同。结果表明,在ACADM(498bp-504bp)和ALDH2(219bp-225bp)基因的3’UTR上存在与bta-miR-224成熟序列特异性结合的位点,bta-miR-224与ACADM和ALDH2基因存在靶标关系,ACADM和ALDH2基因是bta-miR-224的靶基因。为了探究bta-miR-224对ACADM和ALDH2基因在转录水平的调控作用,利用实时荧光定量法检测了bta-miR-224和它的靶基因在奶牛的乳腺上皮细胞中差异表达水平。结果显示,bta-miR-224的相对表达量为:转染bta-miR-224 mimics组表达量极显著高于转染bta-miR-224 inhibitor组和shNC组(p0.01)。q PCR检测结果显示,在转染了载体的奶牛乳腺上皮细胞中,转染bta-miR-224 mimics组,ACADM相对表达量显著低于转染shNC组和转染bta-miR-224 inhibitor组(p0.05),转染shNC组与转染mi R-224 inhibitor组ACADM的表达量无显著差异(p0.05)。ALDH2基因的相对表达量为:转染bta-miR-224 mimics组的乳腺上皮细胞,ALDH2相对表达量显著低于转染shNC组和转染bta-miR-224 inhibitor组(p0.05),转染shNC组与转染bta-miR-224 inhibitor组ALDH2的表达量无显著差异(p0.05)。经过SPSS 22.0软件相关性分析表明:bta-miR-224和ACADM、ALDH2基因之间存在负向调控的关系。以上研究表明,bta-miR-224能够在转录水平对ACADM、ALDH2基因进行调控,并且验证了bta-miR-224在转录水平对ACADM和ALDH2基因有下调作用。为进一步探究bta-miR-224在ACADM和ALDH2基因翻译水平发挥的作用,通过Western blot检验ACADM、ALDH2基因蛋白水平的表达情况。结果显示,转染bta-miR-224mimics组ACADM、ALDH2基因的蛋白表达量显著低于转染bta-miR-224 inhibitor组和shNC组(p0.05),转染bta-miR-224 inhibitor组和shNC组的ACADM、ALDH2基因的蛋白表达量无显著差异(p0.05)。结果表明,在奶牛乳腺上皮细胞中,bta-miR-224能够对ACADM、ALDH2基因进行翻译水平的调控,其通过靶向ACADM、ALDH2基因对ACADM、ALDH2蛋白表达量进行调控,并且bta-miR-224对ACADM、ALDH2基因在蛋白水平上有负调控的作用。甘油三酯生成量检测结果说明,bta-miR-224 mimics组的乳腺上皮细胞中甘油三酯的产量显著低于shNC组的表达量(p0.01),而bta-miR-224 inhibitor组甘油三酯的表达量显著高于转染shNC组(p0.05)。在此之后,我们调试了流式细胞仪,进行检测乳腺上皮细胞凋亡情况,结果显示,bta-miR-224 mimics组细胞凋亡率高于转染bta-miR-224inhibitor组和shNC组细胞凋亡率。结果表明,bta-miR-224的高表达会导致乳腺上皮细胞凋亡率增加。结论:(1)ACADM和ALDH2基因是bta-miR-224的靶基因;(2)在奶牛乳腺上皮细胞中,bta-miR-224能够对ACADM和ALDH2基因进行转录水平和翻译水平的调控,可以降解ACADM和ALDH2基因靶m RNA的表达,并且抑制ACADM和ALDH2基因翻译成蛋白质;(3)bta-miR-224高表达会降低奶牛的乳腺上皮细胞中甘油三酯的生产并且能够促进奶牛乳腺上皮细胞的凋亡比率,提示bta-miR-224会参与奶牛的乳脂代谢过程,并且影响乳腺组织的生长发育,从而影响奶牛的泌乳情况。
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S823

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