稳定表达西尼罗病毒prM-E蛋白细胞系的构建

发布时间：2017-12-16 14:12

  本文关键词：稳定表达西尼罗病毒prM-E蛋白细胞系的构建

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【摘要】：西尼罗病毒(West Nile Virus,WNV)属黄病毒科,黄病毒属,是一种重要的人兽共患传染病病毒。多种鸟类和哺乳动物对该病毒易感,其中马受WNV的危害最为严重。人感染该病毒后可导致西尼罗热,严重者出现中枢神经系统疾病,甚至可致死亡。该病毒对养殖业和人类健康都构成了巨大威胁。WNV尚无特异性的治疗方法,疫苗免疫接种是控制该病的主要措施。目前国外已经报道了几种兽用WNV疫苗,我国尚且没有可用的WNV疫苗。传统减毒活疫苗和灭活疫苗免疫原性比较好,但仍存在缺陷,如灭活苗免产生疫应答较慢,只能诱导低水平体液免疫,弱毒疫苗具有有潜在性安全问题等,因此研究者们致力于研发更为安全有效的新型疫苗。研究表明WNV prM-E蛋白能够在哺乳动物细胞中表达,并自我组装成病毒样颗粒(VLPs)。该病毒样颗粒与天然的病毒颗粒在诱导机体免疫应答方面有着相似的能力。本实验室在之前的研究中已经利用哺乳动物表达系统成功表达了流行性乙型脑炎病毒(JEV)病毒样颗粒。因此,本实验拟构建一个能够持续稳定表达WNV VLPs的真核细胞系,为后续制备WNV亚单位疫苗奠定基础。为鉴定细胞系表达目的蛋白情况,本实验制备并筛选了一株WNV prM蛋白特异性单克隆抗体。该单抗细胞上清和腹水ELISA效价分别为1:2048和1:409600以上;单抗亚型鉴定结果表明10F7属于IgG2a,其轻链类型为κ链;Western blot和IPMA结果显示,该单抗与WNV prM特异性反应,与JEV无交叉反应。将编码WNV prM蛋白和E蛋白基因的重组质粒pCAG-opti-WNV-prME转染进BHK-21细胞,然后用含有G418的选择性培养基培养,经多次亚克隆并结合间接免疫荧光(IFA)和抗原捕获ELISA方法筛选,最终得到一个能够稳定表达WNV prM-E蛋白的细胞系W-92。IFA和流式细胞术试验结果表明该细胞系持续到第30代仍然保持高水平的蛋白表达。对W-92细胞系表达产物分离纯化后电镜观察,结果表明prM蛋白可与E蛋白组装成病毒样颗粒。将该病毒样颗粒抗原免疫小鼠后,可检测到较高效价的ELISA抗体;诱导的抗体具有病毒中和作用,对WNV的中和抗体效价为1:40,对JEV的中和效价介于1:20~1:80,有一定程度的交叉保护作用。将纯化后的VLPs免疫鹅后,其血清的JEV中和效价介:1:20~1:40之间。在使用JEV病毒P3株对小鼠致死性病毒攻击试验中,免疫小鼠保护率为50%-70%。本实验构建了一株能持续稳定表达WNV prM-E蛋白的真核细胞系,为WNV亚单位疫苗的制备及诊断方法的研究提供了物质基础。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65

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本文编号：1296312