弓形虫pSMART2b-SAG3 DNA疫苗的研制及其初步应用

发布时间：2017-12-20 02:12

  本文关键词：弓形虫pSMART2b-SAG3 DNA疫苗的研制及其初步应用　出处：《吉林大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：弓形虫病(toxoplasmosis)是由胞内寄生的刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)引起的一种能引起怀孕妇女及怀孕母畜流产等严重危害的人兽共患病,在中国是二类动物传染病。且目前用于防治弓形虫病的药物主要是磺胺类药物与抗菌增效剂,长期使用药物对公共卫生安全影响很大,同时在国内用于预防和控制弓形虫病的疫苗暂时没有,为解决这一现状,本研究以RH株弓形虫SAG3基因为抗原分子,并成功构建了重组质粒pSMART2b-SAG3,且以兔抗SAG3蛋白血清证明了该基因所表达蛋白具有免疫原性,然后对小鼠后肢肌肉进行注射重组质粒pSMART2b-SAG3,最后检测其细胞免疫和体液免疫的情况,并分析其对小鼠抗RH株弓形虫速殖子攻击后的保护效果,以此来初步探索该重组质粒作为DNA疫苗的潜力。重组质粒pSMART2b-SAG3构建、表达和鉴定将RH株弓形虫速殖子纯化后,通过Trizol法提取其总RNA并反转录为c DNA,然后以该c DNA为模板扩增SAG3基因的CDS,成功扩增出了除掉信号肽部分的SAG3基因,大小为1068bp,接着成功连接p MD-18T克隆载体和甲病毒复制子载体pSMART2b,生物测序结果均为100%,最后将重组质粒pSMART2b-SAG3及载体pSMART2b转染入293T细胞并用兔抗SAG3蛋白血清证明了其蛋白具有良好的免疫原性。重组质粒pSMART2b-SAG3对小鼠抗弓形虫效果研究将成功构建的重组质粒pSMART2b-SAG3及空载体pSMART2b经小鼠后肢肌肉注射,免疫剂量分别为50μg/只和100μg/只,三次免疫后检测、评估其细胞及体液免疫情况,MTT法检测小鼠脾脏淋巴细胞增殖情况及流式细胞仪检测CD4+和CD8+含量变化,统计分析各组体重变化、存活率,最后针对肺脏基因组进行实时荧光定量虫子数量。结果显示,重组质粒免疫小鼠后,随着免疫次数的增加其抗体滴度、IL-2、IFN-γ、SI以及CD4+和CD8+数量均逐渐升高,且较对照组差异明显;免疫结束后,用RH株弓形虫1×103个/只攻击小鼠(除阴性对照),攻虫后2周内以pSMART2b-SAG3(50μg)组的存活率为最高(18.75%),pSMART2b-SAG3(100μg)组的存活率为6.25%,其余组均无存活;同时经统计分析显示试验组小鼠的平均体重较对照组体重减少缓慢;并且重组质粒50μg/只较100μg/只的剂量免疫注射小鼠后的免疫保护效果更佳;最后通过绝对实时荧光定量各组肺脏弓形虫速殖子数目,结果pSMART2b-SAG3(50μg)组为105.02个,比阳性对照降低25.95%。总之,重组质粒pSMART2b-SAG3对小鼠抗弓形虫感染能起到一定的保护效果。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.7

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