重组质粒pSMART2b-Rhomboid3的构建及抗柔嫩艾美耳球虫的初步应用

发布时间：2017-12-22 18:02

  本文关键词：重组质粒pSMART2b-Rhomboid3的构建及抗柔嫩艾美耳球虫的初步应用　出处：《吉林大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：鸡球虫病是由艾美耳属(Eimeria)的球虫寄生于鸡肠道引起的一种寄生性原虫病,尤以柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)的致病力最强,故成为本病防治的重点。由于该病严重影响鸡体的生长发育、产蛋率等,对养鸡业的危害巨大,据相关统计,每年给全世界造成的经济损失达30多亿美元。然而,目前防治该病主要依靠药物和活球虫疫苗,但长期使用药物防治球虫病会导致耐药虫株以及药物残留等问题,且活疫苗存在散毒、毒力反祖等问题。故研制出一种免疫效果好、使用安全的疫苗用于预防和控制鸡球虫病是有必要。本研究以柔嫩艾美耳球虫的Rhomboid3基因作为抗原分子,用真核表达载体pSMART2b传递和表达该抗原分子,并将该重组质粒导入293细胞中进行表达,然后将重组质粒免疫鸡只,检测其引起鸡体的细胞免疫及体液免疫情况,最后通过攻虫试验,计算抗球虫指数(ACI)来综合评价重组质粒pSMARAT2b-Rhomboid3对鸡群球虫病的保护效果,以此来初步探索其成为球虫疫苗的潜力。重组质粒pSMARAT2b-Rhomboid3的构建及表达提取柔嫩艾美耳球虫的总RNA并反转录为c DNA,通过PCR扩增Rhomboid3基因,然后连接p MD-18T、pSMARAT2b并在DH5α中克隆,且通过测序及酶切鉴定,大小为774bp。接着将重组质粒pSMARAT2b-Rhomboid3通过LipofectamineTM2000转入293细胞表达,并用鸡抗柔嫩艾美耳球虫的阳性血清做Western blot分析,证明Rhomboid3蛋白具有反应原性。重组质粒pSMARAT2b-Rhomboid3诱导鸡体的免疫应答将构建的重组质粒pSMARAT2b-Rhomboid3和空载体pSMARAT2b分别用50μg和100μg的剂量经腿部肌肉免疫注射鸡只,每次间隔1周共免疫3次,然后对抗体水平、细胞因子(IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ)水平、T淋巴细胞增殖情况及毒性T淋巴细胞活性进行测定。结果表明,免疫剂量50μg和免疫剂量100μg组的抗体水平、IL-2、IFN-γ、T淋巴细胞增殖及毒性T淋巴细胞活性都有明显升高(P0.01),免疫剂量100μg组比免疫剂量50μg组的高,且两个免疫组与对照组相比,差异极显著(P0.01)。重组质粒pSMARAT2b-Rhomboid3抗柔嫩艾美耳球虫保护效果通过重组质粒pSMARAT2b-Rhomboid3经三次免疫鸡只后,进行攻虫试验,结果表明免疫重组质粒50μg和100μg剂量组的与红对照组相比,卵囊数明显减少,体重增加,盲肠病变减少,且差异显著(P0.05)。经过综合评价免疫剂量50μg组和免疫剂量100μg组的ACI分别为181.25和184.22,均显示出较好的保护效果。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S858.31

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本文编号：1320450