柞蚕滞育蛹解除滞育过程中糖含量变化及海藻糖合成酶基因的表达分析

发布时间：2017-12-22 19:17

本文关键词：柞蚕滞育蛹解除滞育过程中糖含量变化及海藻糖合成酶基因的表达分析　出处：《沈阳农业大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：柞蚕(Antheraea pernyi)属于鳞翅目大蚕蛾科柞蚕属的泌丝昆虫,属完全变态昆虫,一生经历卵、幼虫、蛹和成虫四个不同的生理阶段,以蛹滞育的形式渡过恶劣的外界环境。研究柞蚕蛹滞育的解除,为实现柞蚕"一化二放"提供理论依据。选用沈阳农业大学辽宁省昆虫资源工程技术研究中心保育的沈黄1号和河南省蚕业科学研究院保育的豫大1号为材料,研究光照解除柞蚕滞育蛹滞育方法、测定了柞蚕蛹海藻糖和糖原的含量、克隆了柞蚕海藻糖合成酶基因(ApTPS),并对该基因进行了生物信息学分析、组织表达谱分析、实时荧光定量、原核表达和Western Blot等研究,结果如下:1.柞蚕品种沈黄1号和豫大1号滞育蛹解除滞育研究结果表明,400 Lux、17L:7D的光照组合对豫大1号的滞育解除效果最好,校正羽化率为80%,羽化高峰出现较早;260 Lux、17 L:7 D的光照组合对沈黄1号的滞育解除效果较好,最高校正羽化率为89.9%;400 Lux、17 L:7D组合的羽化高峰期最早。荧光灯处理下,豫大1号的平均校正羽化率较沈黄1号低9.1%,羽化持续时间长19.16 d。2.柞蚕滞育蛹解除滞育期间海藻糖和糖原含量测定结果表明,豫大1号和沈黄1号的海藻糖含量在滞育解除过程中无明显的变化规律,豫大1号在自然光处理期间糖原含量无明显变化规律,在400 Lux、17 L:7D光照处理期间,糖原含量呈先下降后上升的趋势,而沈黄1号的糖原含量在400 Lux、17 L:7 D光照和自然光光照处理下都呈持续下降的趋势。3.克隆获得了柞蚕海藻糖合成酶基因ApTPS(GenBank收录号为KU977454),开放阅读框ORF长2 487 bp,编码828个氨基酸,推测其蛋白分子量为93.19 KDa,等电点(pI)4.61,无信号肽,无跨膜区,蛋白质亚细胞定位预测该蛋白定位于细胞质中。蛋白质结构域分析表明,ApTPS有2个保守功能区:TPS(第22-497位氨基酸)和TPP(第532-772位氨基酸)。4.采用半定量RT-PCR技术对柞蚕幼虫各组织ApTPS基因特异性分析表明,ApTPS基因在柞蚕各组织中均有表达,其中脂肪体中表达量最高。采用实时荧光定量PCR技术检测了柞蚕蛹解除滞育过程的ApTPS基因表达量,ApTPS基因在脂肪体和血淋巴中的表达量均有所升高且显著高于对照组(P0.05),血淋巴中表达量的升高滞后于脂肪体。5.以pET-28a为质粒,设计引物构建ApTPS基因原核表达载体,对表达的目的蛋白进行了纯化,制备了抗体和Western blot等验证,结果表明ApTPS基因原核表达重组载体构建成功,通过对柞蚕蛹滞育解除期间脂肪体ApTPS的Western Blot分析,结果与实时定量PCR的结果一致,都呈现先升高后降低的趋势。
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S885.1

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