多拉菌素基因工程菌株的构建

发布时间：2017-12-26 04:28

本文关键词：多拉菌素基因工程菌株的构建　出处：《南阳师范学院》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：多拉菌素(Doramectin)是一种新型大环内酯类抗寄生虫药物,可安全高效驱杀猪、牛、羊等家畜的体内和体表寄生虫,已被广泛应用于畜牧业生产。多拉菌素是美国辉瑞公司研发的阿维菌素第三代衍生物,可由基因改造阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)发酵产生。我国是全球最大的阿维菌素生产基地,产能过剩,但相关企业普遍因技术原因无法实现产品更新换代,国内多拉菌素市场仍主要依靠进口。阿维链霉菌bkdFGH基因编码的支链α-酮酸脱氢酶参与阿维菌素起始单元的合成,其缺失突变可导致阿维链霉菌丧失产生阿维菌素的能力。但当在该突变菌株的发酵过程中添加环己烷甲酸为前体时,就可产生多拉菌素(CHC-B1),同时也会得到CHC-B2、CHC-A1和CHC-A2等无效的多拉菌素类似物。aveD基因编码的C5-O-甲基转移酶可介导多拉菌素B组分向A组分的转化,从而降低发酵产物中多拉菌素的含量。此外,阿维链霉菌中功能未知基因aveC的特定位点突变也有可能提高产物中多拉菌素有效组分的比例。因此,为获取能够生产多拉菌素的菌株,应对阿维链霉菌中bkdFGH, aveD和aveC这三个基因进行改造。本研究以筛选获得的阿维菌素高产菌株为出发菌株,通过基因工程技术对多拉菌素合成基因bkdFGH, aveD和aveC进行改造,获取能够高效产生多拉菌素的工程菌株,并对其发酵条件进行初步优化,为构建稳定高效产生多拉菌素的工程菌株奠定基础。取得的主要结果如下：1.利用同源双交换法构建bkdFGH基因缺失阿维链霉菌突变菌株,在其发酵过程中添加外源前体环己甲酸,发酵产物经高效液相色谱检测发现有多拉菌素(CHC-B1)产生,但同时还有CHC-A1和CHC-A2等无效组分。在此基础上进而对aveD基因进行缺失,构建成功bkdFGH和aveD双缺失突变株,检测发现其仍可发酵产生多拉菌素(CHC-B1),但CHC-A1和CHC-A2等无效组分的含量显著降低。2.在获得bkdFGH和aveD双缺失阿维链霉菌突变菌株的基础上,采取两种方法对aveC基因进行改造：1)利用同源双交换将aveC基因缺失；2)利用全基因合成技术获得包含10个突变位点的aveC*,然后将其整合入bkdFGH和aveD双缺失突变株基因组中,获取可高效表达aveC*的突变株。对其发酵产物分别进行检测,发现aveC缺失可阻断阿维链霉菌中多拉菌素的生物合成,这说明aveC对多拉菌素生物合成是必需的。而该基因的定点改造则能提高多拉菌素的产量,但并未显著改变产物中CHC-B1和CHC-B2的比例。3.以上述突变菌株为研究对象,检测发酵时间、氮源和无机盐等因素对基因改造阿维链霉菌合成多拉菌素能力的影响,通过单因子实验初步摸索最佳发酵条件。结果显示：多拉菌素最佳发酵时间为13天,最佳单一氮源为棉籽粉,在培养基中添加七水合硫酸锌可提高多拉菌素产量。
【学位授予单位】：南阳师范学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S859.79;Q78

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