产气荚膜梭菌α毒素抗体捕获ELISA检测方法的建立和初步应用

发布时间：2017-12-30 00:10

  本文关键词：产气荚膜梭菌α毒素抗体捕获ELISA检测方法的建立和初步应用　出处：《山东农业大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：产气荚膜梭菌(C.perfringens)又名魏氏梭菌,是一种广泛存在于自然界和动物肠道中的细菌,属于条件性致病菌。可产生多种外毒素和酶类,主要产生α、β、ε和ι四种毒素,其中α毒素是产气荚膜梭菌最重要的毒素,各种类型的产气荚膜梭菌均可产生α毒素。目前,对畜禽产气荚膜梭菌感染抗体检测方法主要有小鼠中和试验、卵磷脂酶抑制试验等,但因其操作过程复杂、耗时长,不适于大批量临床样品的检测。国外已经出现多种检测产气荚膜梭菌疾病的商品检测试剂盒,但价格昂贵。所以为了弥补国内空白急需建立快速、灵敏、特异并能大批量应用于检测该病的方法。本研究采用实验室保存的分泌抗产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞F12,通过扩大培养、接种小鼠、收集腹水、腹水纯化等程序得到α毒素单克隆抗体,并对其效价进行了测定。用实验室保存的产气荚膜标准菌株NCTC528进行复苏、增菌、产毒、提纯等程序得到外毒素,并对其浓度进行检测。选取1.0-1.5 Kg健康未接种过疫苗的家兔5只,利用灭活的α毒素和弗氏完全佐剂按照等体积混合乳化按照设定免疫程序对家兔进行免疫制备高免血清。上述经纯化后的单克隆抗体F12作为包被抗体,提纯后的外毒素作为捕获抗原,高免血清作为捕获ELISA的阳性对照血清,从而建立了α毒素抗体捕获ELISA检测方法。通过对各步反应条件的优化,最终获得最佳工作条件为:单抗1:6400稀释即工作浓度为0.33μg/m L,待检血清1:160稀释,抗原1:1000即工作浓度为2μg/m L。用建立好的ELISA方法检测33份阴性血清,计算其平均值X=0.243与标准差SD=0.015,求得阳性临界值为0.288,阴性临界值为0.273,当血清检测值C"g0.288(C=X+3SD)时判定为阳性,C"f0.273(C=X+2SD)时为阴性,0.288C0.273时为可疑。特异性结果表明:该方法对大肠杆菌,沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌分别免疫兔子所得血清无特异性交叉反应。敏感性实验表明:本研究制备的兔抗α毒素高免血清,采用本研究建立的捕获ELIS A方法测得抗体效价1:640,经典小鼠中和实验测得中和抗体效价为1:400,本研究建立的ELISA方法敏感性较高。重复性实验得出批内变异系数为1.21%~6.53%,批间变异系数为1.78%~7.31%,两者均小于10%,说明同一样品在同批和不同批试验中变异程度小,说明该方法具有很好的重复性。上述结果说明,已成功建立特异性、敏感性、重复性好的用于α毒素抗体捕获ELI SA检测方法。该方法为免疫效果的测定提供了一种新的途径,为临床快速诊断产气荚膜梭菌疾病奠定了基础,同时在食品安全等方面具备很好的应用前景。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.61

【参考文献】

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1 李课;刘雪慧;王海荣;柴同杰;;C、D型二价产气荚膜梭菌抗毒素血清的制备及保护效果评价[J];中国兽药杂志;2016年08期

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5 李璐;赵宝华;;产气荚膜梭菌主要致死性毒素的研究进展[J];畜牧与饲料科学;2011年04期

6 于晓霞;姚美玲;张彬;柴同杰;;SDS-PAGE法检测产气荚膜梭菌毒素型研究[J];西北农林科技大学学报(自然科学版);2007年12期

7 王红宁;;仔猪腹泻成因及综合防治技术措施[J];中国畜牧杂志;2006年06期

8 王海荣,唐德宏,鹿道新,樊丽,柴同杰;畜舍环境中魏氏梭菌分离及基因型鉴定[J];中国人兽共患病杂志;2005年11期

9 张红英,杨霞,卢中华;魏氏梭菌肠毒素研究进展[J];中国畜牧兽医;2004年09期

10 张红英,卢中华,杨霞,王亚宾,金钺;我国魏氏梭菌病的流行特点[J];中国畜牧兽医;2004年01期

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本文编号：1352465