融合表达TM-1基因和gD基因重组腺病毒的构建及免疫效果评价

发布时间：2017-12-31 01:09

  本文关键词：融合表达TM-1基因和gD基因重组腺病毒的构建及免疫效果评价　出处：《天津农学院》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

  更多相关文章： 鸡传染性喉气管炎 gD基因 鸡慢性呼吸道疾病 TM-1基因 重组腺病毒构建 免疫效果评价

【摘要】：鸡慢性呼吸道疾病(Chronic Respiratory Dsiease,CRD)是由鸡毒支原体(Mycoplasma Gallisepticum,MG)感染引起的慢性、接触性呼吸道疾病。CRD以慢性呼吸道症状,机体免疫力降低,易引起继发感染为主要特征,可引起鸡群生产性能降低,胴体废弃,常给国内外养鸡业造成了十分严重的经济损失。TM-1蛋白是一种溶血素膜蛋白,与MG粘附宿主细胞相关,是诱导机体产生保护性免疫的主要抗原之一,保守性高,变异率低。鸡传染性喉气管炎(Infectious Laryngotracheitis,ILT)是由传染性喉气管炎病毒(Infectious Laryngotracheitis Virus,ILTV)引起的鸡的一种急性上呼吸道传染病,该病可导致鸡只死亡,产蛋量减少,呈世界性地分布,已成为危害养禽业的重要疫病之一。gD糖蛋白是ILTV复制和诱导宿主产生免疫应答反应的主要保护性抗原。本试验通过质粒PCR、双酶切及测序鉴定后,将含有TM-1和gD基因的pMD-TM-1和pMD-gD进行双酶切,经T4酶连接于克隆载体pDC315-EGFP上,PCR、酶切及测序鉴定后分别获得穿梭载体pDC315-TM-1、pDC315-gD和pDC315-TM-1-gD;利用LipoFiterTM脂质体转染法将重组穿梭载体与腺病毒大骨架pBHGlox(delta)E1,3cre共转染HEK293细胞,在真核细胞中实现同源重组,经荧光显微观察、RT-PCR和Western blotting检测,包装出能表达TM-1蛋白、gD蛋白和TM-1-gD融合蛋白的重组腺病毒pBH-TM-1、pBH-gD和pBH-TM-1-gD;P4代重组腺病毒感染48 h后,提取HEK293细胞总RNA,RT-PCR法检测TM-1和gD基因的表达,同时提取细胞总蛋白,经Western blotting检测TM-1蛋白、gD蛋白及TM-1-gD融合蛋白的表达量;使用Vivapure AdenoPACKTM法纯化病毒粒子,以TCID50法确定重组腺病毒pBH-EGFP、pBH-TM-1、pBH-gD和pBH-TM-1-gD的滴度分别为109.5TCID50/mL、109.625TCID50/mL、109.25TCID50/mL和1010.125TCID50/m L,符合后续动物试验所需滴度要求;肌肉注射免疫SFP雏鸡,间隔7d加强免疫1次,免疫鸡只未出现呼吸道症状,且免疫鸡体重无明显降低(p0.05);于免疫后7 d、14 d、21 d、28 d采血,间接ELISA结果显示重组腺病毒pBH-TM-1、pBH-g D免疫效果与疫苗组无显著差异(p0.05),双基因pBH-TM-1-gD诱导MG抗体水平则极显著低于常规疫苗组(p0.01),但其诱导的ILTV抗体水平与常规疫苗组无差异(p0.05);脾脏指数分析结果显示:与对照组合pBH-EGFP相比较,重组腺病毒pBH-TM-1、pBH-gD、pBH-TM-1-gD和疫苗组均显著升高(p0.05),但重组腺病毒pBH-TM-1、pBH-gD、pBH-TM-1-gD和疫苗组均无显著性。本研究首次将MG的TM-1基因和ILTV的gD基因融合重组,并成功构建可用于真核系统表达的重组腺病毒pBH-TM-1-gD,在与常规疫苗对比的基础上探讨其免疫效果,为研制鸡毒支原体病和鸡传染性喉气管炎两种禽类接触性呼吸道传染病二联基因工程活载体疫苗提供参考,同时也为新型禽类呼吸道疫苗提供理论基础。
[Abstract]:The recombinant adenovirus pDC315 - TM - 1 , pDC315 - gD and pDC315 - TM - 1 - gD were obtained by PCR , double digestion and sequencing . The results showed that the recombinant adenovirus pBH - TM - 1 , pBH - gD , pBH - TM - 1 - gD and the vaccine group had no significant difference ( P < 0.05 ) . The results showed that the recombinant adenovirus pBH - TM - 1 , pBH - gD and pBH - TM - 1 - gD had no significant difference ( P < 0.05 ) . The results of the indirect ELISA showed that the recombinant adenovirus pBH - TM - 1 , pBH - gD , pBH - TM - 1 - gD and the vaccine group had no significant difference ( P < 0.05 ) .

【学位授予单位】：天津农学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S858.31

【参考文献】

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本文编号：1357378