胆碱对奶牛肝细胞脂质沉积中蛋白谱和代谢谱的影响

发布时间：2018-01-20 11:43

本文关键词： 奶牛脂肪肝 iTRAQ蛋白质组学 GC/MS代谢组学差异蛋白差异代谢物　出处：《黑龙江八一农垦大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：围产期奶牛常处于能量负平衡(NEB)和免疫抑制状态,NEB期间体脂动员释放出大量非酯化脂肪酸(NEFA),肝脏吸收NEFA导致肝脏中脂蛋白代谢的损伤,大量甘油三酯蓄积在肝脏内。极低密度脂蛋白(VLDL)是反刍动物肝脏清除甘油三酯的主要形式,磷脂、胆固醇脂以及甘油三脂是合成VLDL的主要成分,而胆碱是肝脏合成磷脂的重要前体物质。目前,在奶牛营养管理中常补充过瘤胃胆碱以改善围产期奶牛的肝脏脂质代谢和免疫功能。然而添加胆碱可影响肝脂代谢中哪些通路,目前尚不明确。据此,本项目用NEFA模拟能量负平衡环境建立犊牛肝细胞的脂肪沉积模型,在添加氯化胆碱的基础上,利用iTRAQ技术和GC/MS对牛肝细胞脂质代谢特征进行系统全面分析,阐明胆碱对能量负平衡所致的肝脂沉积的主要代谢的调节作用,为今后奶牛脂肪肝的防治奠定基础。本实验采用两步胶原酶灌流法对犊牛肝细胞进行分离培养,细胞正常培养48 h后,饥饿培养6 h观察细胞状态良好,继续后续实验。1)采用时间梯度及密度梯度法,通过评价TG、TC、GLU、AST、GLO和NEFA等肝脂沉积敏感指标,确定NEFA诱导细胞最佳时间、氯化胆碱添加的最佳浓度及氯化胆碱添加的最佳时间。2)在确立NEFA诱导肝细胞脂肪沉积的时间及氯化胆碱添加的浓度及时间后,应用iTRAQ技术检测两组(NEFA vs.Con、N+CHO vs.NEFA)犊牛肝细胞样品,获得两组间的差异蛋白,再进行GO和KEGG分析,确定差异蛋白的代谢通路。3)应用GC/MS技术检测两组(NEFA vs.Con、N+CHO vs.NEFA)犊牛肝细胞样品,获得两组间的差异代谢物,再进行差异代谢物的生物信息学分析,确定差异代谢物参与的代谢通路。结果显示:1)NEFA诱导肝细胞12 h与6 h和空白对照组相比细胞TG、TC和NEFA水平较高,说明细胞处于肝脂沉积状态,且12 h为最佳时间;通过对NEFA诱导的肝细胞中添加不同浓度的氯化胆碱孵育的肝细胞的结果显示细胞TG、TC、NEFA和GLO的水平有所下调,说明胆碱对NEFA诱导的肝脂沉积症状有所缓解,且10μm/dl胆碱孵育6 h效果最佳。2)通过iTRAQ检测和GO分析,NEFA vs.Con组共检测出143个差异蛋白,其中下调蛋白有88个,有L-乳酸脱氢酶A链、山梨醇脱氢酶、果糖-二磷酸醛缩酶、磷脂转运ATP酶、氧固醇结合蛋白和己糖激酶等。上调蛋白有55个,有肌动蛋白、脂肪酸结合蛋白、组蛋白、β-酪蛋白、精氨酸酶和线粒体丙酮酸载体等。筛选出的差异蛋白主要参与类固醇激素生物合成、糖酵解/糖异生、氨基酸的生物合成、RNA转运和碳代谢等代谢通路;N+CHO vs.NEFA组共检测出74个差异蛋白,其中下调蛋白有30个,有线粒体丙酮酸载体、线粒体输入内膜转位子亚基和跨膜蛋白等。上调蛋白有44个,有异柠檬酸脱氢酶、脂滴包被蛋白、肉碱O-棕榈酰转移酶1、载脂蛋白C-III和氧化低密度脂蛋白受体等。筛选出的差异蛋白主要参与PPAR信号通路、RNA转运和剪接体等代谢通路。3)通过GC/MS检测和多元统计分析,Con vs.NEFA组共检测出21个差异代谢物。其中下调代谢物有8个,有乳糖酸、O-磷酸乙醇胺、亚油酸、月桂酸、β-甘露糖基甘油酸酯、20α-羟基胆固醇、洋地黄毒糖、6-氨基青霉烷酸。上调代谢物有13个,有腺嘌呤、α-色氨酸、琥珀酸、十七烷酸、2-羟基吡啶、乙醇酸、十五烷酸、葡萄糖酸、丙二酰胺等。其差异代谢物主要参与亚油酸代谢、类固醇激素生物合成等代谢通路;NEFA vs.N+CHO组中共检测出14个差异代谢物,其中下调代谢物有4个,有3-羟基丙酸、磷霉素、胆甾烷-3,5,6-三醇、苏糖酸。上调代谢物有10个,有乳糖酸、硬脂酸、腺嘌呤、花生四烯酸、2-甘油-棕榈酸酯、丙二酰胺、β-甘露糖基甘油酸酯、水杨酸、胸苷和瓜氨酸。其差异代谢物主要参与不饱和脂肪酸的生物合成和花生四烯酸代谢等代谢通路。结论:本研究首次应用iTRAQ蛋白质组学和GC/MS代谢组学技术,结合多元统计分析和生物信息学技术,获得了NEFA vs.Con组和NEFA vs.N+CHO组差异蛋白和差异代谢物,揭示了NEFA诱导的肝细胞脂质沉积的组学机制和胆碱对肝细胞脂类沉积中差异蛋白和代谢物的调控作用,为今后深入探索奶牛脂肪肝发病机理奠定了基础。
[Abstract]:In this experiment , we used the technique of iTRAQ and GC / MS to study the lipid metabolism and immune function of bovine hepatocytes . The levels of TG , TC , NEFA and GLO in NEFA - induced liver cells were downregulated . The metabolites of NEFA vs . Con and NEFA vs . N + CHO were mainly involved in the biosynthesis of unsaturated fatty acids and metabolic pathways of arachidonic acid .

【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S823

【参考文献】