家蚕淡墨突变体（bd）雌性不育的分子机制研究

发布时间：2018-01-21 07:06

本文关键词： 家蚕 bd突变体雌蛾不育转录因子卵子发生　出处：《西南大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：强大的生殖能力是昆虫繁衍生息的重要基础,而卵子发生(Oogenesis)作为昆虫生殖的重要环节,是发育生物学研究的热点。卵子发生为后期的胚胎发育提供了重要基础:其中卵母细胞进行减数分裂形成雌原核为受精提供了配子;卵母细胞吸收并储存的卵黄原蛋白为受精后胚胎发育提供营养物质;而卵室进行形态构建形成的卵子为胚胎发育提供了场所。研究发现,昆虫的卵子发生涉及复杂的分子调控网络,对该过程进行分子水平的研究,能进一步理解生殖及胚胎发育的遗传基础,也为探究昆虫繁衍与进化提供线索。家蚕是重要的农业经济昆虫,并具有重要的历史和文化价值。自20世纪初期以来,经历数代人的收集保存、诱变创造,积累了丰富的家蚕突变体,为生物学研究提供了良好的资源。随着家蚕基因组数据的公布以及长期的生物学关注,其被作为鳞翅目的模式昆虫,为鳞翅目昆虫的生物学研究提供参考。本研究以家蚕雌不育突变体淡墨(black dilute,bd)为材料,淡墨突变体具有幼虫体壁黑化和雌蛾不育的双重表型。在本小组先前的研究中,通过定位克隆与功能验证等手段鉴定了该突变体的突变基因是一个编码BTB-ZF类型的转录因子,Bmbd。在本研究中,我们通过一系列表型分析鉴定了bd突变体是一个卵子发生异常的突变体,同时分析其雌性不育的原因和发生缺陷的关键时期;随后通过对Bmbd基因从分子生物学、生物信息学和细胞生物学等水平进行分析,探究其如何影响家蚕bd突变体卵子发生。对家蚕中与卵子发生相关突变体的研究,能为鳞翅目昆虫雌性生殖发育及卵子发生的调控机制研究提供参考,同时也为鳞翅目害虫防治提供潜在靶标。主要研究结果如下:1.家蚕bd突变体不育原因的分析对野生型和家蚕bd突变体雌性内生殖发育、卵子发生和交配受精等生物学过程进行比较分析探究不育的发生原因。通过解剖雌性内生殖系统和卵巢管DAPI染色观察,bd突变体生殖系统发育、卵子发生过程与对照相比没有观察到显著差异;结合扫描电镜与受精卵DNA染色观察,发现bd突变体卵孔孔道异常导致精子不能正常进入卵中;人工孤雌生殖实验表明bd突变体卵存在发育潜能缺陷。综上所述,卵孔孔道异常与卵存在发育潜能缺陷是bd突变体不育发生的主要因素。其中,卵孔孔道形成与卵室内边界细胞的形成与迁移相关,在bd突变体中卵孔孔道异常可能是边界细胞的异常形成或迁移所致。2.Bmbd基因在家蚕卵子发生过程中的时空表达模式分析Bmbd基因作为家蚕bd突变体的突变基因,我们分别对家蚕卵巢及卵巢管中不同发育时期的卵室进行取材,通过荧光定量PCR方法和原位杂交实验检测Bmbd基因在卵巢发育与卵子发生过程中的表达情况,分析其在家蚕卵子发生过程中可能的作用时间与部位。荧光定量PCR结果表明Bmbd基因在家蚕生殖细胞分化关键时期(4龄眠前后)和卵子发生过程中卵室成熟发育阶段(5龄早期和上簇至化蛹期)具有相对较高的表达水平;进一步通过原位杂交实验发现其在卵子发生过程早期具有较高表达,且表达主要集中在滤泡细胞中。3.Bmbd基因上下游调控基因的筛查与分析分别对Bmbd基因转录起始上游区域进行转录因子结合位点分析、通过bd突变体转录组数据筛查选取潜在的下游基因进行分析,鉴定Bmbd基因上下游可能相互作用的基因。通过genomatix网站预测分析发现Bmbd基因上游存在与边界细胞形成与迁移密切相关的STAT和slow border cells两个转录因子的结合位点。通过对转录组数据筛查选取了与卵子发生相关的Bmovo-1基因和与染色质形成相关的BmHp1b-l基因,对这两个基因在野生型中的表达模式进行分析并选取关键表达时期检测其在bd突变体中的表达情况。结果显示,相对于野生型,这两个基因在bd突变体中均具有显著表达差异,分析发现这两个基因均可能作为Bmbd基因的下游靶基因参与影响家蚕bd突变体生殖异常的发生。并进一步推测,bd突变体中Bmbd基因的功能缺陷,可能引起边界细胞形成或迁移异常,从而引起卵孔结构破坏,同时该基因的缺陷可能导致下游Bmovo-1和BmHp1b-l基因表达水平改变,造成不育的发生。4.Bmbd基因功能验证与相互作用蛋白的鉴定通过构建细胞表达载体对Bmbd基因两种剪切形式进行核定位分析,结果发现Bmbd-1主要集中在细胞质中表达,而Bmbd-2集中于细胞核周围与细胞核中表达,两种剪切形式所编码的蛋白核定位的差异暗示着其具有不同的作用方式。通过构建Bmbd基因在细胞中的过表达载体以及合成dsRNA,在家蚕卵巢细胞系中分别过表达和干涉Bmbd基因,结果发现Bmbd基因表达下调会引起家蚕卵巢细胞的迁移受阻,这进一步验证了Bmbd基因在边界细胞迁移过程中起重要作用。Bmbd基因编码具有BTB结构域的蛋白,而包含BTB功能域的蛋白可结合其他蛋白形成蛋白复合体进行作用,我们通过免疫共沉淀实验鉴定了Bmbd-1蛋白能与边界细胞迁移相关的重要蛋白Actin和Ral-a结合。本部分我们在细胞水平证实Bmbd基因会影响细胞的迁移,并可能与Actin和Ral-a蛋白相互作用影响该过程。
[Abstract]:In this study , we identified the genetic basis of the development of the eggs and provided a reference for the development of the embryonic development . It was found that Bmbd gene could be used as the downstream target gene of Bmbd gene to affect the expression of Bmbd gene . The results showed that Bmbd gene could be used as downstream target gene of Bmbd gene to be involved in the formation and migration of Bmbd gene . The results showed that Bmbd gene could be used as downstream target gene of Bmbd gene to form protein complex .

【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S881.2

【参考文献】