RNA-Seq分析盐逆境下棉花种子萌发基因表达动态变化

发布时间：2018-02-10 04:02

本文关键词： 棉花盐胁迫转录组萌发转录因子　出处：《西南大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：棉花(Gossypium hirsutum L.)是我国最重要的农作物之一,是农民增收和满足国民经济发展需求的重要战略性物资。萌发是种子生命周期的起始,对植物生命历程具有决定性的作用,然而外界环境变化对种子萌发具有关键性的影响。我国6.7%以上的耕地为盐碱地,相比其它作物,棉花对土壤盐碱的耐受力相对较高,但含盐量0.3%以上的土壤仍严重抑制棉花种子的萌发,影响其成苗率,从而成为棉花盐碱地种植的关键限制因素。近年来,由于气候变化加剧,土壤盐碱化加重,加之棉花产区向盐碱程度较高的东部沿海和西北内陆地区集中,盐害胁迫已经成为棉花产业发展的重要限制因素。本研究利用我国棉花主栽品种柯字棉73为研究材料,通过分析不同盐浓度下的萌发率,确定0.6%和0.8%Na Cl作为实验浓度,利用RNA-Seq分析种子萌发过程中基因表达动态变化。结合转录组数据和生物信息学分析,主要获得如下的结果:1)萌发实验表明,外界盐浓度为0.0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、2.0%时,柯字棉种子萌发率依次为:100.00%、83.33%、73.33%、66.67%、46.67%、10.00%、0.00%、0.00%。外界盐浓度高于1.0%时,棉花种子几乎不能萌发。结合棉花实际栽培环境常遇到的盐害浓度,选取0.6%和0.8%盐浓度作为转录组实验浓度。2)RNA-Seq共获得114,139,977条clean reads,其中87%的clean reads可以比对到陆地棉基因组序列,以|log2(fold change)|1(2倍以上差异表达)和FDR≤0.001为标准,共获得26650个差异表达的基因(Differentially expressed genes,DEGs)。3)分析表明,随着盐处理时间的延长,差异表达基因数目逐渐上升;而不同盐浓度下,同一时间点0.8%Na Cl处理样本差异表达基因明显高于0.6%Na Cl浓度。不同萌发时间点比较,0%Na Cl对照组、0.6%Na Cl和0.8%Na Cl条件下,4h和0h相比较差异基因的个数依次为:1483、315和869;8h和4h相比,差异基因个数依次为:1603、1613和942;24h和8h相比较,差异基因依次为:13625、4604和3885。相同时间点,不同盐浓度处理下,和对照组相比较,0.6%和0.8%Na Cl浓度条件下差异表达基因分别为:4h,914(0.6%)和1529(0.8%);8h,625(0.6%)和1146(0.8%);24h,10649(0.6%)和15552(0.8%)。以上数据表明种子萌发过程,不同时间点发生着不同的生理变化,需要不同类型和数量的基因调控;而萌发过程对不同浓度的盐逆境存在相同和相异的表达调控。4)转录因子在生物学发育、逆境响应等过程都有重要的调控作用。本实验共有74个家族、1053个转录因子编码基因表达发生显著性的变化,包括ERF(138)、b HLH(103)、WRKY(93)、NAC(66)、ARF(51)、GATA(48)、MYB(44)、HSF(36)、Trihelix(35)等;而且这些转录因子在不同的时间点呈现不同的分布,比如4h时主要的差异转录因子为ERF(38)、WRKY(28)、GATA(12)等,8h时主要为WRKY(16)、HSF(12)、ERF(11)等,而24h时主要为ERF(90)、b HLH(63)、WRKY(59)等,说明种子萌发不同的时期需要不同的转录因子调控,而很多转录因子又具有相对特异性的调控功能。很多转录因子成员被研究报道参与植物逆境下萌发或发育等调控或响应,进一步证明这些转录因子在逆境条件下种子萌发中具有重要的生物学功能。5)根据基因连续时间表达特征,利用K-mean分析可以将差异表达基因分为30个聚类。对不同聚类的基因进一步GO发现:聚类7、8、10与转录过程、DNA修复、RNA加工和泛素介导的蛋白质降解有关;聚类21主要富集细胞信号转导途径;聚类1、6、12、14主要富集碳水化合物代谢、物质运输、微管运动、新陈代谢过程;聚类4、5主要与逆境应答过程相关;聚类15、20、24、28主要参与翻译过程;而聚类2、13主要参与蛋白质磷酸化过程。6)Pathway分析表明,萌发后4h、8h、24h三个时间点,0.6%Na Cl浓度下表现出差异的基因有54个,pathway显著富集在糖代谢通路,PFP酶和PFK酶有显著差异。0.8%Na Cl浓度下表现出差异的基因有168个,pathway富集结果显示次生代谢物的生物合成、谷胱甘肽代谢、蛋白质加工、糖酵解/葡萄糖途径、碳代谢有显著差异。两个浓度下都有差异的基因有17个。7)对差异基因在A-、D-亚基因组比较分析发现,差异基因中,A-亚基因组表达的基因有12990个,包括509个转录因子;D-亚基因组表达的基因有13384个,包括534个转录因子。对这些基因pathway分析发现他们大多富集在相似的代谢途径。此外,A-亚基因组有8960个同源基因、D-亚基因组有9008个同源基因表达。以上结果表明,棉花A-亚基因组和D-亚基因组对棉花耐盐响应不具有明显的差异。综上,利用转录组实时分析,本研究获得了一系列盐逆境下种子萌发差异表达基因。这些基因的获得,一方面验证了棉花中耐盐响应同源基因的诱导表达,另外获得了更多棉花盐胁迫响应特异的基因。实时转录组分析提供了棉花种子萌发过程转录调控的全局性认识,同时也为深入研究逆境条件下种子萌发提供了更多的基因源。这些实验结果,对于棉花耐逆基因工程和耐逆育种具有一定的参考价值。
[Abstract]:The results were as follows : 1 ) The germination rate of cotton was 100 . 00 % , 83.33 % , 73.33 % , 66.67 % , 46.67 % , 10.00 % , 0.00 % . The results showed that the number of differentially expressed genes increased gradually with the time of salt treatment . The results showed that there were 12990 genes with different transcription factors . The results showed that there were 12990 genes , including 509 transcription factors , HLH ( 63 ) , WRKY ( 59 ) in different time points . In this study , we have obtained a series of genes for differential expression of seed germination under adverse conditions of cotton by using transcriptome real - time analysis . On the one hand , we have verified the induction expression of salt - tolerant response homologous genes in cotton , and also obtained the genes specific for the stress response of cotton seeds . In addition , we provide more gene sources for the germination of cotton seeds .

【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S562;Q943.2

【参考文献】