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草鱼ATF6和XBP1介导的GRP78及GRP94的转录调控机制分析

发布时间:2018-02-22 12:57

  本文关键词: 草鱼 ATF6 XBP1S GRP78 GRP94 转录调控 出处:《南昌大学》2017年硕士论文 论文类型:学位论文


【摘要】:ATF6和XBP1S是与内质网应激相关的重要的碱性亮氨酸拉链(basic leucine zipper,bZIP)结合型转录因子,属于CREB/ATF(cAMP应答元件结合蛋白)蛋白家族成员。他们均是未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)信号通路的关键调控因子,通过调控UPR靶基因的转录来调控细胞适应内质网应激的保护性蛋白。当细胞的内质网处于应激状态时,细胞内将先产生一种ATF6核内活性形式(ATF6N),ATF6N通过内网应激反应顺式元件(ERSE)激活葡萄糖调节蛋白的表达(主要是GRP78和GRP94)和激活未剪切的XBP1(unspliced XBP1,XBP1U)mRNA。同时IRE1α发生二聚化及磷酸化后就在XBP1U m RNA的特定内含子-外显子区域剪切掉26个核苷酸,导致开放阅读框移动编码更长的XBP1(spliced XBP1,XBP1S)。XBP1S进入细胞核内,激活ER应激反应中的相关蛋白及ERAD,从而缓解内质网应激状态,促进内质网的内平衡。为了了解鱼类ATF6作为一种转录调控因子对下游靶基因的调控机制,我们克隆了草鱼ATF6的全长序列(KT279356),分析其蛋白结构,发现其N端含有一个非常保守的BRLZ结构域。同时,克隆了草鱼GRP78和GRP94启动子序列。通过荧光定量PCR实验,我们分析了CiATF6在不同组织及衣霉素刺激作用下的表达特性。实验结果表明CiATF6在所测组织中均有表达,且在肝脏组织中表达量最高;同时衣霉素刺激草鱼肾细胞(CIK细胞),也能上调CiATF6的表达。原核表达了CiATF6N,镍柱亲和层析获得纯化蛋白。体外凝胶阻滞实验显示纯化的体外重组蛋白Ci ATF6N对CiGRP78和CiGRP94启动子片段有明显的阻滞效果,说明CiATF6是CiGRP78和CiGRP94潜在的转录调控因子。之后,我们构建了真核表达载体pcDNA3.1-CiATF6和pcDNA3.1-CiATF6-nBRLZ,与pGL-CiGRP78P和pGL-CiGRP94P瞬时共转染至CIK细胞,发现CiATF6能显著上调CiGRP78P和CiGRP94P的荧光素酶活性。为进一步研究草鱼ATF6对XBP1的转录调控,我们克隆了长度为1036 bp的CiXBP1的启动子,同时克隆了CiXBP1S基因的全长。通过荧光定量PCR实验,我们分析了CiXBP1S在不同组织及衣霉素刺激作用下的表达特性。实验结果表明CiXBP1S在所测组织中均有表达,且在肝脏组织中表达量最高;衣霉素刺激草鱼CIK细胞,发现衣霉素能上调CiXBP1S的表达。利用在线软件分析发现CiXBP1的启动子含有一个及其保守的ERSE元件,我们构建了pGL-CiXBP1P及其突变体pGL-CiXBP1P-P1和pGL-CiXBP1P-P2荧光素酶报告基因重组质粒,双荧光素酶活性实验分析,发现pGL-CiXBP1P及pGL-CiXBP1P-P2具有高启动子活性,而pGL-CiXBP1P-P1几乎没有活性。同时分析CiXBP1S的蛋白结构,同样发现其N端含有一个BRLZ结构域,原核表达并获得了CiXBP1S及其突变体CiXBP1S-nBRLZ蛋白。体外凝胶阻滞实验发现CiATF6N对pGL-CiXBP1P-P2有阻滞效果,而对pGL-CiXBP1P-P1没有此现象。同时,我们发现CiXBP1S也有同样的现象。双荧光素酶活性实验进一步证实了CiATF6能激活CiXBP1的转录,更有趣的是我们发现Ci XBP1S能上调pGL-CiXBP1P-P2的双荧光素酶活性值,对pGL-CiXBP1P-P1也没有此现象,表明CiXBP1S具有自调控功能。为了探索CiXBP1S对CiGRP78和CiGRP94转录调控,体外凝胶阻滞实验分析其与CiGRP78和CiGRP94启动子片段的亲和性,发现CiXBP1S对CiGRP78和CiGRP94启动子片段具有显著地阻滞现象,同时发现CiXBP1S-nBRLZ却没有此现象,表明Ci XBP1S的BRLZ结构域对其调控下游靶基因非常重要。进一步的双荧光素酶活性实验结果也证实了这一点,CiXBP1S能显著上调CiGRP78和CiGRP94启动子的活性,而CiXBP1S-nBRLZ却不能。
[Abstract]:ATF6 and XBP1S are important basic leucine zipper ( bZIP ) binding transcription factors related to endoplasmic reticulum stress , belonging to the family members of the CREB / ATF ( cAMP response element binding protein ) protein family . They are the key regulatory factors of unfolded protein response ( UPR ) signaling pathway . In order to study the expression of CiATF6 in different tissues and CigrP94 promoter fragments , we cloned the promoter of CiXBP1S gene . The results showed that CiATF6 could increase the expression of CiXBP1S in different tissues and CiGRP94 .

【学位授予单位】:南昌大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S917.4

【参考文献】

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本文编号:1524461

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