陆地棉GhSPO11-3基因的克隆与功能分析

发布时间：2018-02-26 07:16

  本文关键词： 陆地棉 GhSPO11-3基因 核内复制 病毒诱导的基因沉默 盐胁迫　出处：《郑州大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：棉花是世界上重要的纤维和油料作物,盐胁迫对棉花生长发育及产量有显著的影响。相关报道指出SPO11-3基因与植物的耐盐性相关。SPO11-3基因是真核生物拓扑异构酶VI A亚基的同源基因,在高等植物中广泛存在,参与调控植物一些重要的生物过程,如植物的生长、发育,适应胁迫等过程。但目前关于棉花SPO11-3基因的研究鲜有报道。本研究以拟南芥的AtSPO11-3基因的序列在陆地棉数据库中进行BLAST搜索,得到相似性最高的序列,设计引物,从陆地棉中克隆出该基因,暂命名为GhSPO11-3。为进一步研究该基因的功能,本试验构建了与GFP基因融合的亚细胞定位载体,通过农杆菌转化到洋葱表皮以进行瞬时表达。通过病毒介导的基因沉默(Virus induced gene silencing,VIGS)技术对棉花进行侵染,得到基因沉默的棉花植株后,通过盐胁迫处理后幼苗生长期的生理生化实验。本研究获得以下主要研究结果:1.从陆地棉品种“中棉所79”中克隆到目的基因。GhSPO11-3的开放阅读框ORF含有1254 bp,编码417个氨基酸。GhSPO11-3基因在进化上相对比较保守,GhSPO11-3蛋白同样包含N末端TP6A_N结构域和保守的催化结构域Toprim。序列分析显示GhSPO11-3基因与可可和拟南芥氨基酸序列同源性较高。进化树分析也显示出棉花GhSPO11-3蛋白与可可和拟南芥同源蛋白的进化距离很近。2.实时荧光定量PCR分析发现GhSPO11-3基因在各个组织中均有表达,在植物叶片中表达量最高,属于组成型表达的基因。通过洋葱表皮的瞬时表达进行亚细胞定位分析,结果显示GhSPO11-3主要定位于细胞核中。3.将构建正确的重组质粒pYL-156-GhSPO11-3导入农杆菌GV3101中,当棉花还未长出真叶时侵染棉花子叶,待阳性对照的棉花植株出现花白斑时,提取对照组和基因沉默的植株的RNA,结果表明,基因沉默的棉花植株目的基因mRNA的表达水平受到抑制。与对照组相比基因沉默的棉花植株在表型上出现生长迟滞的现象。通过流式细胞仪分析细胞倍性,结果显示GhSPO11-3基因沉默的实验组细胞的核内复制水平比对照组低,在荧光显微镜下观察到基因沉默的细胞核比对照组的小。4.对GhSPO11-3基因沉默的植株和TRV:GFP对照组植株进行盐胁迫处理,基因沉默的植株萎蔫严重而对TRV:GFP对照组植株影响较小。在氯化钠盐处理下,对棉花植株的生理指标进行测定,结果显示GhSPO11-3的沉默导致棉花植株在生理变化中更敏感,在盐胁迫后基因沉默的棉花植株总叶绿素含量和脯氨酸含量与对照组相比要低,而丙二醛(MDA)含量相对较高。荧光定量PCR检测耐盐相关基因的表达量发现,在盐胁迫两周后,NCED3、P5CS、RD29A和DREB1A基因表达水平显著低于对照植株。这些结果表明GhSPO11-3基因沉默的植株表现出更敏盐的现象。本研究获得了陆地棉的GhSPO11-3基因,分析了该基因的结构、组织表达特点以及该基因在核内复制和盐胁迫中的作用。研究结果表明GhSPO11-3基因的沉默导致核内复制水平的降低,进而降低植物对盐胁迫的耐受性。本研究为GhSPO11-3基因的进一步研究提供了理论指导,也为提高棉花对盐胁迫的耐受性提供了一个有效的遗传学的手段。
[Abstract]:In this study , it was found that the gene was cloned from upland cotton . The results showed that Ghout11 - 3 gene was cloned from upland cotton . The results showed that Ghout11 - 3 gene was cloned from upland cotton . The results showed that Ghout11 - 3 gene was cloned from upland cotton . The results showed that the gene silencing resulted in the decrease of the level of endogenous replication and the tolerance of plant to salt stress . The research provided theoretical guidance for the further study of Ghout11 - 3 gene , and provided an effective method to improve the tolerance of cotton to salt stress .

【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S562

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本文编号：1537012