微小隐孢子虫感染对HCT-8细胞自噬的影响

发布时间：2018-03-05 18:22

本文选题：微小隐孢子虫　切入点：HCT-8　出处：《吉林大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：微小隐孢子虫是一种人兽共患寄生性原虫,主要侵染宿主肠道上皮细胞,破坏微绒毛结构,造成肠道功能紊乱,引发腹泻。微小隐孢子虫主要以水源性传播为主,人类和动物通过饮用污染有微小隐孢子虫卵囊的水后可引发感染。免疫功能缺陷或低下的人群极易感染,如老人、儿童以及HIV患者等。其中HIV患者感染后可引起持续性腹泻,极易导致脱水、休克,甚至死亡。目前尚无有效的办法对微小隐孢子虫病进行防治。究其原因,是对微小隐孢子虫与宿主细胞的相互作用关系不清晰。有研究表明,自噬可以帮助细胞清除入侵病原,维护细胞健康。弓形虫在入侵宿主细胞后可以引发细胞自噬,并且利用细胞自噬产生的能量进行自身的增殖,从而增强弓形虫对细胞的持续性感染。微小隐孢子虫和弓形虫同属胞内寄生性原虫,微小隐孢子虫入侵宿主细胞后对细胞自噬影响如何,以及微小隐孢子虫感染与细胞自噬之间有何关系尚不清楚。本研究旨在研究微小隐孢子虫入侵对宿主细胞自噬的影响,并探究细胞自噬与微小隐孢子虫感染之间的关系。微小隐孢子虫诱导HCT-8细胞自噬的检测。以HCT-8细胞作为感染模型,通过Western blot、间接免疫荧光技术、EGFP-LC3质粒转染以及透射电子显微镜观察等如下系列试验探究微小隐孢子虫感染对HCT-8细胞自噬的影响:1、Western blot试验:提取不同培养时间的细胞总蛋白进行Western blot试验,检测自噬标记蛋白LC3、Beclin-1等的变化。结果发现,微小隐孢子虫子孢子与HCT-8细胞共培养后,LC3I和LC3II逐渐积累增加,表明细胞有明显的自噬现象;Beclin-1在8h时累积最多,表明8h时细胞自噬强度最强。2、间接免疫荧光检测:微小隐孢子虫子孢子感染HCT-8细8h后,清洗并固定细胞,进行间接免疫荧光试验,于激光共聚焦显微镜下观察LC3蛋白的变化。结果显示,微小隐孢子虫子孢子与HCT-8细胞共培养8h后,细胞内LC3蛋白荧光斑点呈点状或者聚集状分布,表明细胞发生自噬。3、EGFP-LC3质粒转染及检测:对HCT-8细胞进行EGFP-LC3质粒转染试验后与微小隐孢子虫子孢子共培养,收取不同培养时间的细胞后进行固定、DAPI染色,于激光共聚焦显微镜下观察LC3蛋白的动态变化情况。结果显示,随着微小隐孢子虫子孢子与HCT-8细胞共培养时间的延长,EGFP-LC3斑点数量逐渐增加,表明细胞自噬强度逐渐增强。4、透射电子显微镜观察:共培养8h后,收集并清洗细胞,制作超薄切片,并于透射电子显微镜下寻找并观察微小隐孢子虫子孢子和自噬泡的显微结构。结果显示,微小隐孢子虫子孢子可以侵入HCT-8细胞内形成带虫空泡,并首次观察到伴随有自噬泡的产生,表明微小隐孢子虫子孢子入侵HCT-8细胞后可引发细胞自噬。微小隐孢子虫诱导HCT-8细胞自噬相关通路蛋白的检测。微小隐孢子虫子孢子与HCT-8细胞共培养8h,收集并清洗细胞,提取全蛋白后进行Western blot试验,检测PI3K、AKT、MTOR、AMPK、ULK1等自噬相关通路蛋白的变化。结果发现:与对照组相比,实验组中PI3K、AKT、MTOR均下调,而AMPK、ULK1均无明显变化,表明微小隐孢子虫可能通过PI3K-AKT-MTOR通路引发HCT-8细胞自噬。Ra和3-Ma处理细胞对微小隐孢子虫感染的影响。使用自噬诱导剂雷帕霉素(Ra)和自噬抑制剂3-Ma分别预处理HCT-8细胞后,进行微小隐孢子虫和HCT-8细胞共培养,建立微小隐孢子虫荧光定量标准曲线,并使用荧光定量PCR检测微小隐孢子虫的感染状况。结果表明:自噬诱导剂Ra处理细胞后,微小隐孢子虫的感染显著减弱,3-Ma处理细胞后,微小隐孢子虫的感染显著增强。综上所述,微小隐孢子虫可以诱导HCT-8细胞发生自噬,其中PI3K-AKT-m TOR通路参与自噬过程中的信号转导;自噬诱导剂Ra处理细胞对微小隐孢子虫的感染有一定的抑制作用;3-Ma处理细胞对微小隐孢子虫的感染有一定的增强作用。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.723

【参考文献】