宁夏酿酒葡萄卷叶伴随病毒多重RT-PCR检测及变异群体的SSCP分析

发布时间：2018-03-11 09:42

本文选题：宁夏贺兰山东麓　切入点：葡萄卷叶伴随病毒　出处：《宁夏大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：葡萄卷叶伴随病毒(Grapevine Leafroll associated virus,简称GLRaVs)是世界范围内分布最广,造成损失最严重的一种葡萄病毒病,已成为世界葡萄栽培地区中的一个严重问题。宁夏贺兰山东麓地区是国内重要的酿酒葡萄栽培基地之一,有关GLRaVs在宁夏酿酒葡萄植株中的感染情况、GLRaVs的分子检测、株系变异及其与分子特性关系的研究报道较少。本研究在对宁夏酿酒葡萄病毒病田间自然发病情况调查的基础上,建立了 GLRaVs多重RT-PCR检测体系,并对GLRaVs宁夏分离物的分子变异及群体结构进行PCR-SSCP分析,从而为宁夏GLRaVs群体结构变化监控及病害控制奠定基础。研究结果如下:1、对宁夏贺兰山东麓8个种植地区8个酿酒葡萄品种的病毒病田间自然发病情况进行调查,采用RT-PCR方法,检测了共40份样品中GLRaV-1～5这5种葡萄卷叶伴随病毒的感染率。结果表明:宁夏贺兰山东麓酿酒葡萄主要病毒病有葡萄卷叶病、扇叶病和栓皮病,其中葡萄卷叶病尤为严重;不同种植区和品种间葡萄卷叶病的感染存在着差异,老葡萄种植区中品种间葡萄卷叶病发病率明显高于新葡萄种植区的品种;“蛇龙珠”和“黑比诺”是感染葡萄卷叶病毒的主要品种,发病率高达85.1%和52.7%;利用5种葡萄卷叶伴随病毒特异性引物进行RT-PCR检测,仅检出3种病毒类型,且GLRaV-3的检出率最高,为87.5%。2、对宁夏贺兰山东麓酿酒葡萄卷叶病进行RT-PCR检测,在单一RT-PCR检测的基础上,对2种卷叶伴随病毒的多重RT-PCR模板浓度、引物浓度、退火温度和TaqDNA聚合酶浓度进行了优化,建立了同时检测GLRaV-1和GLRaV-3的多重RT-PCR技术体系。模板浓度、引物浓度和TaqDNA聚合酶量对多重RT-PCR的扩增有很大的影响,而退火温度对检测结果的影响相对较小。对2种葡萄卷叶伴随病毒的PCR产物进行克隆和测序,扩增基因片段与GenBank中登录的基因序列同源性为96%-99%。所建立的多重RT-PCR技术检测田间样品效果良好。3、采用SSCP技术对所检测到的8个GLRaV-1宁夏分离物和13个GLRaV-3宁夏分离物进行遗传变异分析。经SSCP分析可知,8个GLRaV-1宁夏分离物之间有明显差异,可归为3类;13个GLRaV-3宁夏分离物之间也有明显差异,GLRaV-3-CP和GLRaV-3-HSP70分离物均归为2类,而GLRaV-3-RdRp分离物归为3类。分离物在不同种植区间和不同品种间均表现差异性。4、对获得的阳性样品进行GLRaVs的CP、HSP70和RdRp基因组的克隆和测序分析。结果表明,GLRaV-1宁夏分离物GLRaV-1-NX1和GLRaV-1-NX2的CP基因序列为232bp,其两种分离物间的核苷酸序列同源率为90%,与已报道的国内外其它分离物CP基因序列相比,核苷酸序列同源率为 90%-99%;GLRaV-3 宁夏分离物 GLRaV-3-CP-NX1 和 GLRaV-3-CP-NX2 的 CP 基因序列为942bp,其两种分离物间的核苷酸序列同源率为40%,与已报道的国内外其它分离物CP基因序列相比,核苷酸序列同源率为40%-99%;GLRaV-3宁夏分离物GLRaV-3-NX的RdRp基因序列为683bp,其各分离物间的核苷酸序列同源率为90%以上,与已报道的国内外其它分离物RdRp基因序列相比,核苷酸序列同源率为90%-99%;GLRaV-3宁夏分离物GLRaV-3-NX的HSP70基因序列为546bp,其两种分离物间的核苷酸序列同源率为96%,与已报道的国内外其它分离物HSP70基因序列相比,核苷酸序列同源率为96%-99%。
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【学位授予单位】：宁夏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S436.631

【参考文献】