bta-miR-33a靶基因的验证及对奶牛乳脂代谢调控的研究

发布时间：2018-03-14 23:00

本文选题：奶牛乳腺上皮细胞　切入点：bta-miR-33a　出处：《吉林大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：本文依据microRNA(以下简称miRNA)在组织或细胞内可特异性结合靶基因3’UTR的靶标位点并调控其表达从而发挥生物学功能,通过验证miRNA在奶牛乳腺上皮细胞中与候选靶基因的靶标关系,为探讨其调控乳脂代谢的分子机制提供理论基础。实验室前期利用高通量测序及其生物信息学分析技术分别对高乳脂率和低乳脂率乳腺中miRNA的表达模式进行鉴定,分析得到bta-miR-33a具有差异表达性,且在低乳脂率乳腺中低表达,在高乳脂率乳腺中高表达。通过靶基因预测和KEGG功能注释等生物学分析技术以及试验验证手段,筛选出bta-miR-33a的候选靶基因及与乳脂代谢调控相关的基因。因此,本研究利用双荧光素酶报告基因检测系统对bta-miR-33a的候选靶基因ELOVL6、HADHB进行验证,再在奶牛乳腺上皮细胞中转染bta-miR-33a的模拟物,检测bta-miR-33a与预测靶基因在细胞中的表达水平关系,并利用生物学试验手段进一步探究bta-miR-33a在乳腺上皮细胞中对调控乳脂代谢的相关基因的影响。首先,利用双荧光素酶报告基因法验证bta-miR-33a与候选靶基因ELOVL6、HADHB的靶标关系。通过miRbase及Targetscan对候选靶基因的ELOVL6、HADHB 3’UTR区进行预测分析,显示在ELOVL6 3’UTR(1132-1138bp)、HADHB 3’UTR(61-67bp)与bta-miR-33a种子区域(CAATGCA)存在特异性结合的靶标位点。将其克隆到pmiR-RB-REPORT?双荧光素酶报告载体中,获得野生型载体(pmiR-RB-REPORT-ELOVL6 WT;pmiR-RB-REPORT-HADHB-WT);利用定点突变技术将ELOVL6和HADHB3’UTR种子区-CAATGCA定点突变-CATGTAGC,获得突变型载体(pmiR-RB-REPORT-ELOVL6 mut;pmiR-RB-REPORT-HADHB-mut)。将ELOVL6和HADHB的野生型载体、突变型载体及其空载分别与bta-miR-33a-mimics共转染至奶牛乳腺上皮细胞,并测定其荧光活性。结果:bta-miR-33a显著降低了ELOVL6和HADHB的野生型载体双荧光素酶活性,并显著低于突变型及空载体组;而突变型组及空载体组之间的荧光值差异不显著。结论:在奶牛乳腺上皮细胞中bta-miR-33a可以与ELOVL6、HADHB 3’UTR的靶位点-CAATGCA特异性结合,ELOVL6、HADHB基因的3’UTR区存在bta-miR-33a的靶位点。然后,将bta-miR-33a mimics、bta-miR-33a inhibitor及NC质粒分别转染至奶牛乳腺上皮细胞,通过实时荧光定量验证bta-miR-33a与ELOVL6、HADHB m RNA水平表达量的关系,并且利用western bolt对ELOVL6及HADHB蛋白水平检测进一步验证。结果:以转染NC组为实验对照,bta-miR-33a mimics组中bta-miR-33a的表达量明显高于bta-miR-33a inhibitor组;而ELOVL6、HADHB的表达量在bta-miR-33a mimics组中显著下降,在bta-miR-33a inhibitor组中表达量显著升高。结论:在奶牛乳腺上皮细胞中bta-miR-33a下调ELOVL6、HADHB的表达,进一步验证了ELOVL6、HADHB是bta-miR-33a的靶基因。最后,利用生物试验方法进一步探究bta-miR-33a对奶牛乳腺上皮细胞中乳脂代谢相关基因的调控。一方面,细胞转染后提取总RNA和总蛋白,检测脂肪酸生物合成通路中与乳脂代谢相关基因CPTIA、SC4MOL,PTPLB,ALOX15的表达水平。结果:与NC组对比,转染bta-miR-33a mimics组中CPTIA、SC4MOL,PTPLB的表达量低于bta-miR-33a inhibitor组,而ALOX15的表达量在bta-miR-33a mimics组中显著高于bta-miR-33a inhibitor组。利用Western bolt对基因ALOX15蛋白水平检测进一步验证得到,在bta-miR-33a mimics组中ALOX15表达量显著增加,在bta-miR-33a inhibitor组中ALOX15表达量显著降低。另一方面,在细胞中通过检测甘油三酯含量的变化可以衡量乳脂代谢的变化。将bta-miR-33a mimics、bta-miR-33a inhibitor及NC质粒分别转染至奶牛乳腺上皮细胞,收集细胞,通过试剂盒检测细胞内甘油三酯的变化。结果:与转染NC组对照,转染bta-miR-33a mimics组中,bta-miR-33a的过表达促进了甘油三酯的合成,而bta-miR-33a inhibitor组内甘油三酯的合成显著降低。结论:bta-miR-33a可作为探讨奶牛乳腺调控机制的miRNA。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S823

【参考文献】