猪流行性腹泻病毒ORF3蛋白亚细胞定位信号的研究
本文选题：PEDV 切入点：ORF3蛋白 出处：《上海海洋大学》2017年硕士论文
【摘要】：猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的急性接触性肠道传染病,主要症状为呕吐、腹泻和脱水。不同年龄的猪都易感染,哺乳仔猪最为严重,给养猪业带来巨大的经济损失。ORF3是目前PEDV基因组发现的唯一的附属基因,ORF3编码ORF3蛋白,ORF3蛋白与病毒毒力有关,因此对PEDV ORF3蛋白开展亚细胞定位信号的研究,有助于了解该蛋白在细胞内的转运及其毒力作用机制。本实验的研究内容和结论如下:⑴实验前期,将DR13 ORF3蛋白克隆至真核表达载体pEGFP-C1中,构建重组质粒pEGFP-PEDV-ORF3,并将它和空载体pEGFP-C1分别转染Vero细胞。16 h后激光共聚焦显微镜(LCM)观察分析,在p EGFP-PEDV-ORF3转染的细胞中,融合蛋白定位在细胞质中,而在pEGFP-C1转染的细胞中,EGFP分布在细胞质和细胞核中。这表明附加的ORF3蛋白本身或者附加的ORF3蛋白中存在某个结构使其定位在细胞质上。⑵为了验证ORF3蛋白中是否存在这种结构,我们结合DR13att ORF3的氨基酸序列和CV777wt ORF3预测跨膜域(TM1:40-63aa、TM2:75-91aa、TM3:116-139aa、TM4:150-173aa)对ORF3蛋白进行了截短分区。第一部分是包含四个预测跨膜域的ORF3(1-173aa),第二部分是非预测跨膜域ORF3(174-225aa),构建重组质粒后分别转染Vero细胞。16 h后LCM分析,在p EGFP-PEDV-ORF3(1-173aa)转染的细胞中,融合蛋白定位在细胞质中,而在pEGFP-PEDV-ORF3(174-225aa)转染的细胞中,融合蛋白分布在细胞质和细胞核中。说明ORF3(1-173aa)中存在某种结构使融合蛋白不进细胞核。⑶为找出ORF3(1-173aa)中使融合蛋白不进细胞核表达的结构,我们将ORF3(1-173aa)截短为两部分,第一部分是ORF3(1-91aa),该部分主要包含TM1和TM2,第二部分是ORF3(92-173aa),该部分包含TM3和TM4,构建重组质粒并分别转染Vero细胞。16 h后LCM观察发现在p EGFP-PEDV-ORF3(1-91aa)转染的细胞中,融合蛋白定位在细胞质中,而在pEGFP-PEDV-ORF3(92-173aa)转染的细胞中,融合蛋白分布在细胞质和细胞核中,表明ORF3(1-91aa)是使融合蛋白不进细胞核的关键结构。⑷为进一步分析ORF3(1-91aa)中是否存在使融合蛋白不进细胞核的关键结构,ORF3(1-91aa)被分为两部分,第一部分为ORF3(1-39aa),该部分不包含预测跨膜域,第二部分为ORF3(40-91aa),该部分包含TM1和TM2,构建重组质粒并分别转染Vero细胞。16 h后LCM观察发现在p EGFP-PEDV-ORF3(1-39aa)转染的细胞中,融合蛋白分布在细胞质和细胞核中,而在pEGFP-PEDV-ORF3(40-91aa)转染的细胞中,融合蛋白定位在细胞质中。为验证ORF3(40-91aa)是否是阻止融合蛋白进入细胞核的关键结构,我们将整段ORF3序列中的40-91aa敲除,并将剩下的片段克隆至表达载体p EGFP-C1中,构建重组质粒pEGFP-PEDV-ORF3(1-39+92-225aa)并转染至Vero细胞。16 h后LCM分析发现融合蛋白分布在细胞质和细胞核中。这个结果表明,ORF3蛋白中除携带有第40位-91位肽的片段外,其余剩下的片段都能进入细胞核,所以我们判断ORF3(40-91aa)是使融合蛋白定位在细胞质的重要结构域。⑸ORF3(40-91aa)中某一部分可能是阻止融合蛋白进入细胞核的重要结构域,因此对ORF3(40-91aa)进行再次截短。ORF3(40-91aa)被分成三部分,第一部分为ORF3(40-63aa),主要包含TM1;第二部分为ORF3(64-74aa),该部分是位于TM1和TM2之间的非预测跨膜域;第三部分为ORF3(75-91aa),该部分包含TM2,构建重组质粒pEGFP-PEDV-ORF3(40-63aa)、pEGFP-PEDV-ORF3(64-74aa)、pEGFP-PEDV-ORF3(75-91aa)后分别转染Vero细胞。16 h后LCM观察结果,在这三个重组质粒转染的Vero细胞中,融合蛋白定位在细胞质和细胞核中。表明ORF3(40-91aa)中这三个单独的氨基酸区段ORF3(40-63aa)、ORF3(64-74aa)、ORF3(75-91aa)都不能阻止融合蛋白进入细胞核。⑹我们证实了TM1,TM2和它们之间的连接多肽都不能阻止融合蛋白进入细胞核,那么这三个部分中的任意两部分会不会同时起作用呢?基于此,我们构建相应的重组质粒pEGFP-PEDV-ORF3(40-74aa)、pEGFP-PEDV-ORF3(64-91aa)、pEGFP-PEDV-ORF3(40-63+75-91aa)并分别转染Vero细胞。LCM观察结果发现,融合蛋白分布在这三个重组质粒转染细胞的细胞质和细胞核中。因此,我们推断ORF3的40-91aa序列是使融合蛋白定位在细胞质的最小单元。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.651
【参考文献】
相关期刊论文 前9条
1 庄金秋;王金良;梅建国;沈志强;丁壮;;猪流行性腹泻病毒SDbz株的分离与鉴定[J];中国兽医学报;2013年05期
2 孔俊岩;曹金荣;单洪波;关丽静;王立琴;王立华;王艳玲;薛凤玉;王晓丹;;猪场病毒性腹泻的控制[J];吉林畜牧兽医;2010年10期
3 孙东波;冯力;陈建飞;时洪艳;佟有恩;刘胜旺;陈洪岩;;猪流行性腹泻病毒CH/JL毒株S基因的克隆、序列分析及线性抗原表位区的鉴定[J];病毒学报;2007年03期
4 余丽芸,侯喜林;流行性腹泻病毒M基因与甲病毒载体重组RNA的构建[J];动物医学进展;2005年05期
5 车小燕,郝卫,丘立文,潘玉先,廖志勇,徐华,陈金军,候金林,Patrick CY Woo,Susanna KP Lau,Kwok Yung Yuen,黄震;SARS病人SARS冠状病毒核壳抗原抗体的变化规律[J];第一军医大学学报;2003年07期
6 吴维忠;猪流行性腹泻病[J];青海畜牧兽医杂志;2001年04期
7 佟有恩,冯力,李伟杰,朱远茂,王明,马思奇;猪传染性胃肠炎与猪流行性腹泻二联弱毒疫苗的研究[J];中国预防兽医学报;1999年06期
8 李树根;李力复;李力施;霍燕琼;林诚斌;童昆周;;猪流行性腹泻病毒的分离及适应传代细胞培养病毒株的建立[J];中国畜禽传染病;1993年06期
9 王继科;刘长明;马思奇;王明;魏凤祥;于文涛;周金法;;猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻病毒的免疫电镜诊断的研究[J];中国畜禽传染病;1991年02期
相关硕士学位论文 前1条
1 杜晓莉;浙江省猪流行性腹泻病毒S1基因变异分析及间接ELISA的建立[D];甘肃农业大学;2014年
，本文编号：1665947
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/zaizhiyanjiusheng/1665947.html
