奶牛乳样和粪样中幽门螺杆菌PCR检测方法的建立及初步应用

  本文关键词：奶牛乳样和粪样中幽门螺杆菌PCR检测方法的建立及初步应用，由笔耕文化传播整理发布。

《四川农业大学》 2015年

奶牛乳样和粪样中幽门螺杆菌PCR检测方法的建立及初步应用

张于  

【摘要】：幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)与上消化道及胃肠道外的多系统疾病相关,但至今其感染人的传染源和传播途径仍不明确。研究表明Hp可能是种食源性致病菌,而牛乳、羊乳是其中最可能的感染来源。目前,在幽门螺杆菌感染的众多诊断方法中,聚合酶链式反应相关技术因灵敏度高,能检出样品中微量的Hp,而广泛应用于各临床样品中Hp的检测。本试验分别以幽门螺杆菌16SrRNA、UreA、glmM基因为靶基因,设计特异性引物,建立奶牛乳样和粪样中幽门螺杆菌的PCR检测方法,并成功应用于奶牛临床样品的检测。1、Hp PCR检测方法的建立：根据NCBI上已公布的Hp 16S rRNA、UreA、glmM基因序列,设计特异性引物。提取H. pylori动物模型适应菌株SS1株菌液(1×108 CFU/ML) DNA作为PCR模板。模板浓度、退火温度、引物浓度及循环数等PCR反应体系及条件经优化后得到以下结果：25μL反应体系中,加入2μL模板DNA,16S rRNA、UreA、glmM基因分别在退火温度为58℃～60℃、48℃～50℃、58℃～60℃时能扩增出777bp、411bp、294bp的目的条带；其中上下游引物(10μM)各0.4μL～0.6μL,循环数为32～35个时扩增效果最好。在此条件下,16S rRNA、UreA、glmM检测的灵敏度分别为101 CFU/ML、103 CFU/ML、103 CFU/ML。同时对比乳样、粪样样品基质条件下PCR检测灵敏度发现,应用UreA、glmM基因检测人工污染的奶牛粪样中幽门螺杆菌时,灵敏性有所下降,为104 CFU/ML。由此可得,本试验建立的PCR方法快速、特异、灵敏、高效,为检测奶牛携带幽门螺杆菌的情况奠定了基础。2、Hp PCR检测方法的应用：采集规模化养殖及散养的共计41头奶牛的乳样和粪样进行检测,成功检出Hp DNA。16S rRNA、UreA、glmM于奶牛乳样中Hp的检出率分别为58.34%、34.15%、14.63%,而粪样中16S rRNA、UreA、glmM检出率分别为19.51%、12.20%及0%。16S rRNA、UreA基因检出率明显高于glmM。

【关键词】：
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.6
【目录】：

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