旋毛虫7TR蛋白人源单链抗体抗A549肿瘤作用研究

发布时间：2018-04-02 12:29

本文选题：旋毛虫　切入点：肿瘤相关抗原　出处：《吉林大学》2017年硕士论文

【摘要】：目前国内外许多研究已经证实,旋毛虫感染对动物体内的肿瘤生长具有抑制作用,但其具体抗肿瘤机制尚不明确。本实验室先前通过对旋毛虫c DNA文库的筛选,已发现旋毛虫与乳腺癌、结肠癌、肝癌、肺癌等多种癌细胞存在相关抗原,并且针这些相关抗原所制备的鼠源高免血清和单克隆抗体均在裸鼠荷瘤模型的治疗实验中取得了较好的抗肿瘤作用。其中本实验室前期以旋毛虫与A549肺癌细胞相关抗原旋毛虫7TR蛋白为抗原制备的鼠源高免血清,在裸鼠荷A549的肿瘤动物模型的治疗实验中,取得了64.77%的抑瘤率。左绍志等利用旋毛虫与肝癌的相关抗原制备的单抗,也在H7402的肿瘤动物模型的治疗实验中获得了良好的治疗效果。但是,鼠源抗体因为高昂的成本而难以大规模生产应用。更重要的是,鼠源抗体在疾病治疗中还没达到满意的效果,多克隆抗体和单克隆抗体都会在人体引起较强的人抗鼠抗体(human anti-mouse antibody,HAMA)反应;而嵌合抗体和CDR移植抗体等改型抗体也存在着治疗效果有限、排斥反应和技术复杂等问题。Huston J S等和Bird R等采用DNA重组技术制备的单链抗体(sc Fv),具有完整的抗原结合位点,分子量只有常规抗体的约1/6,穿透组织能力强,在血液中代谢清除快,全部筛选过程可在体外进行。更重要的是sc Fv能在工程菌中表达,易于基因改造和规模化生产,并可连接抗肿瘤效应分子,构建抗肿瘤融合蛋白,从而将药物导向肿瘤,在肿瘤显像和肿瘤靶向性治疗中具有广阔的应用前景。近几年报道中,已有人将单链抗体直接用于实体瘤治疗的动物实验中,并取得了较好的治疗效果,这也证明了单链抗体药物新的应用潜力。本实验首先对旋毛虫与肺癌A549细胞相关抗原旋毛虫7TR蛋白进行原核表达,表达后的重组蛋白经纯化、复性后,进行了Tomlinson(I+J)人源单链抗体库的的筛选,并用ELISA验证筛选所得阳性抗体分泌菌株。对阳性抗体分泌株所分泌抗体进行纯化后,采用间接免疫荧光抗体检验阳性抗体与A549细胞的结合活性,并采用CCK-8法度检测不同浓度的抗体对A549细胞的生长抑制活性。最后通过荷瘤裸鼠的治疗实验评价抗旋毛虫7TR蛋白人源单链抗体对A549肺癌肿瘤细胞的治疗效果,通过免疫组化分析单链抗体抑制A549细胞的机制。旋毛虫7TR蛋白的原核表达、纯化与复性根据NCBI公布的旋毛虫7TR基因,设计特异性引物,以旋毛虫c DNA为模板,PCR扩增目的基因,并将目的基因克隆到p ET-32a载体,并转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达。对表达蛋白进行DEAE弱离子交换柱柱上复性,并对复性后蛋白进行Cu2+螯合柱亲合层析,最后得到纯化并复性的重组旋毛虫7TR蛋白。Tomlinson(I+J)人源单链噬菌体抗体库的筛选经过四轮针对7TR蛋白的噬菌体抗体富集后,随机挑选2000个侵染了噬菌体的E.coli HB2151单菌落,通过IPTG诱导后取得的上清,经ELISA检验,当样品OD490试≥3OD490阴时,视样品为阳性,进过三轮平行验证以及对p ET-32a标签抗体和奶粉抗体的去除,此过程中最终共筛选出9株阳性克隆:1A2、2B1、2B8、4C7、5D1、6D2、7H5、7H9、8G5。经ELISA初步检测,其中只有8G5具有较好的A549结合活性。7TR阳性抗体的A549结合活性检测纯化8G5抗体后,通过激光共聚焦观察间接免疫荧光结果,发现8G5单链抗体具有较好的A549结合活性。经Ig blast分析,8G5为完整的人源单链抗体。7TR蛋白人源单链抗体体内外抗A549肿瘤作用采用CCK-8法检测抗旋毛虫7TR蛋白人源单链抗体的体外抗A549肺癌作用,结果发现当单链抗体对A549细胞的最高生长抑制率为23.29%。体内抗A549肿瘤实验结果显示,单链抗体的最高抑瘤率为59.10%。利用免疫组化分析抗旋毛7TR人源单链抗体治疗后肿瘤组织癌细胞增殖凋亡相关基因PCNA、VEGF、Bcl-2的表达情况,结果表明经旋毛虫7TR人源单链抗体治疗后,PCNA、VEGF表达均下调,Bcl-2基因表达无明显变化。并且,HE染色结果显示,7TR单链抗体在治疗A549肿瘤后,裸鼠的心、肝、脾、肺、肾均未出现病理组织学变化。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.7

【参考文献】