中药单体靛玉红抗LPS诱导的小鼠乳腺炎作用及机制研究

发布时间：2018-04-03 02:10

  本文选题：靛玉红　切入点：脂多糖　出处：《华中农业大学》2017年硕士论文

【摘要】：奶牛乳腺炎是奶牛常见病和多发病,是奶牛场危害大、投入多、难防治的疾病,正制约着我国乃至全球奶牛业的发展。绝大部分奶牛乳腺炎由病原微生物粘附乳腺组织引起,迄今分离鉴定可导致奶牛发生乳腺炎的病原微生物达130多种,其中金黄色葡萄球菌、链球菌及大肠杆菌占80%以上。尽管世界各国学者已对奶牛乳腺炎防治开展了近100余年的不懈研究,至今仍未提出一个可有效防治奶牛乳腺炎的方法。抗生素疗法一直作为防治奶牛乳腺炎的首选方法,伴随其长期大量使用甚至滥用,病原耐药性乃至多重耐药性愈发普遍,逐渐成为制约乳腺炎防治的瓶颈。食源性的动物病原甚至可借助相关食物链和耐药质粒将耐药性传递给人类,给人类疾病防治带来前所未有的挑战和困扰。中草药作为纯天然草药,含多种复杂有效的生物活性成分,具有作用广泛、不会或者难产生耐药性、低毒、无或低残留等优势,兼具药物和营养剂的双重功效,日益受到国内外专家学者的青睐。靛玉红是从中药青黛中分离出的吲哚类化合物,是青黛、大青叶、板蓝根等中药发挥效应的重要成分之一,具有抗肿瘤、抑菌消炎、神经保护、抗病毒和抗寄生虫等方面作用,具有抗生素无法比拟的优势,且在防治奶牛乳腺炎、实现绿色养殖和生产无药物残留动物制品上具有非常好的潜力。因此我们提出了靛玉红具有抗乳腺炎作用的科学设想。本课题从分子、细胞和机体三个不同层次研究靛玉红对LPS诱导的小鼠乳腺炎的防治作用并初步阐明其作用机制,为靛玉红防控奶牛乳腺炎奠定理论及实践基础。主要研究结果如下:1.小鼠乳腺上皮细胞的提取及鉴定妊娠15-20天小鼠乳腺组织采用胰蛋白酶和胶原酶混合消化法提取小鼠乳腺上皮细胞(MMECs),提取的MMECs呈圆形、椭圆或橄榄状生长,在铺板的12小时基本贴壁,48小时长满T75细胞瓶,长满细胞瓶后呈铺路石状、鹅卵石状紧密生长。免疫荧光检测到MMECs细胞质中标记上角蛋白-18的单一明亮的绿色荧光信号,且细胞生长情况良好,纯度较好。2.靛玉红和LPS试验浓度的确定使用不同脂多糖诱导MMECs,24h后收集样品,qRT-PCR检测IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子mRNA表达水平,确定脂多糖诱导MMECs产生炎症反应的最佳浓度。结果显示,随着LPS诱导浓度的升高,三种炎性因子的表达水平都不断上升,在终浓度为1μg/m L时均显著升高(p0.001),并在浓度为0.8-1μg/mL时比1-2μg/mL表达水平上升趋势明显,因此后续试验均选择终浓度为1μg/m L的LPS为诱导浓度。MTT试验检测1-1000nM靛玉红对MMECs活性的影响。结果证明,低浓度的靛玉红(1-250nM)对MMECs活性几乎没有影响,并且与LPS和靛玉红诱导顺序关系不大;250nM以上浓度靛玉红对MMECs存在明显的毒性作用。另用qRT-PCR检测证明25nM以上浓度靛玉红对IL-1β、IL-6和TNF-α具有明显抑制作用(p0.001)。因此后期试验选择25、50和100nM三个浓度靛玉红孵育MMECs,研究靛玉红对MMECs炎症的防治效果,对于动物试验则相应提高1000倍作为试验浓度。3.靛玉红治疗LPS诱导MMECs炎症和小鼠乳腺炎作用及机制研究纯化后的MMECs培养至细胞培养板80%左右,使用LPS诱导MMECs产生炎症作用,1h后使用靛玉红共孵育24h。ELISA和qRT-PCR检测IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平。试验表明,相对于LPS组,靛玉红组中三个促炎因子表达水平都随靛玉红浓度的上升不断下降,并在100nM处显著降低(p0.001)。Western bolt和qRT-PCR检测靛玉红对COX-2活性的影响。试验表明,靛玉红可以剂量依赖性地抑制LPS诱导引起的COX-2活性的增加。从而证明靛玉红可以抑制LPS诱导MMECs的炎症反应。产后5-7d昆明鼠,乳腺灌注LPS建立小鼠乳腺炎模型,对照组乳腺灌注PBS,并在1h和12h分别腹腔注射PBS、0.1%DMSO和靛玉红观察其对小鼠乳腺炎的影响。乳腺组织大体组织及病理学观察,对照组小鼠乳腺没有观察到病理变化;LPS组小鼠乳腺相对于对照组,出现水肿、潮红、变性甚至局部坏死、大量乳汁蓄积,乳腺腺泡壁增厚、大量的中性粒细胞浸润等变化,综合评分较对照组显著升高(p0.001);靛玉红可以改善LPS诱导小鼠乳腺的炎症症状,伴随靛玉红使用剂量增加效果更明显,评分不断下降。ELISA检测靛玉红对小鼠乳腺组织和血清中MPO、IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平的影响。结果证明靛玉红可以剂量依赖性的抑制LPS诱导乳腺炎小鼠中MPO活性和三种促炎因子的表达,对小鼠乳腺炎具有很好的治疗效果。靛玉红抑制脂多糖诱导小鼠乳腺炎的机制是什么,是否与脂多糖引起炎症作用的通路存在相关性呢?我们首先检测了靛玉红对TLR4信号通路的影响。试验证明靛玉红可以剂量依赖性抑制TLR4的表达,发挥对LPS诱导的MMECs炎症和小鼠乳腺炎的治疗作用。靛玉红抑制LPS诱导的NF-κB信号通路的激活,发挥对LPS诱导MMECs炎症和小鼠乳腺炎的治疗作用。靛玉红可以剂量依赖性抑制LPS诱导引起的P50,P65和IκBα的mRNA的表达水平和P65及IκBα磷酸化水平,发挥对LPS诱导MMECs炎症和小鼠乳腺炎的治疗作用靛玉红抑制LPS诱导的MAPK信号通路的激活,发挥对LPS诱导MMECs炎症和小鼠乳腺炎的治疗作用。25、50和100nM靛玉红不影响非磷酸化ERK,JNK和P38蛋白水平,但剂量依赖性抑制LPS诱导的P38、ERK和JNK蛋白的磷酸化水平。在mRNA表达水平上,靛玉红可抑制LPS诱导引起的P38、ERK和JNK表达水平的上升。从而证明靛玉红通过抑制MAPK信号通路的激活,发挥对LPS诱导的MMECs炎症的治疗作用。4.靛玉红对脂多糖诱导小鼠乳腺炎保护性作用及机制研究已证明靛玉红具有治疗小鼠乳腺炎的作用,接着验证靛玉红是否对小鼠乳腺炎具有保护作用并阐明其机制。首先,小鼠乳腺组织大体组织观察和病理切片结果证明,靛玉红同样具有改善LPS诱导小鼠乳腺炎的作用。综合评分显示,LPS组评分大约是对照组分数的6倍,显著升高(p0.001);靛玉红组的评分随着靛玉红剂量的增加不断下降。ELISA检测小鼠乳腺组织和血清中MPO、IL-1β、IL-6和TNF-α的表达,靛玉红可以抑制小鼠乳腺组织和血清中LPS诱导的MPO、IL-1β、IL-6和TNF-α的表达,都呈现剂量依赖性抑制作用,证明靛玉红具有保护LPS诱导小鼠乳腺炎的作用。那么,其保护机制是否与其治疗作用一致呢?接下来使用LPS诱导MMECs炎症反应靛玉红对小鼠乳腺炎的保护性机制研究。首先使用ELISA和qRT-PCR检测LPS诱导MMECs中IL-1β、IL-6和TNF-α促炎因子的表达情况,证明了靛玉红可以剂量依赖性抑制三种促炎因子的表达,并在LPS加入后约3小时开始抑制,在9小时将促炎因子抑制于稳定水平。在COX-2检测中,靛玉红可以剂量依赖性抑制COX-2蛋白和mRNA的表达水平,靛玉红可在LPS诱导后15min开始抑制COX-2蛋白表达,60min左右将其抑制在稳定范围;3小时左右抑制mRNA水平的上升,9小时左右几乎稳定了COX-2的变化。证明靛玉红可以抑制促炎因子和相关的炎性介质的表达,具有调控LPS诱导MMECs产生的炎症反应。使用western blot和qRT-PCR检测TLR4的表达情况,试验证明,25、50和100nM靛玉红可以有效抑制LPS诱导MMECs炎症反应,并且在100nM时可以有效抑制TLR4蛋白和mRNA表达(p0.001)。使用100nM靛玉红预保护MMECs再用LPS诱导,结果显示靛玉红在15min开始抑制TLR4蛋白表达,2小时开始抑制mRNA表达,并在60min将TLR4蛋白水平稳定在正常范围,9小时左右抑制TLR4的mRNA水平在一个相对稳定的水平上。对于NF-κB,靛玉红可以抑制MMECs中P-P65和P-IκBα蛋白水平,并且与靛玉红剂量存在依赖性;100nM靛玉红保护细胞后,可以在LPS诱导MMECs后15min开始抑制两者磷酸化水平,60min基本没有磷酸化。MAPK信号通路的检测中,同样证明靛玉红在使用剂量为25、50和100nM可以剂量依赖性抑制信号通路中P38、ERK和JNK的蛋白磷酸化,但是抑制时间上有差异,靛玉红分别在LPS诱导15min、30min和45min开始抑制P38、ERK和JNK的磷酸化,但是在60min左右基本将磷酸化水平控制在一定范围内。5.靛玉红对脂多糖引起小鼠乳腺上皮细胞凋亡的研究在靛玉红对MMECs凋亡影响中,首先使用罗丹明和DAPI对MMECs进行染色观察细胞形态变化。结果显示,靛玉红可以改善LPS诱导MMECs体积变小、变圆和细胞核缩小等凋亡现象,并且与剂量存在依赖性,靛玉红和LPS对MMECs诱导顺序对凋亡影响不明显。在对凋亡相关基因研究上,靛玉红可以抑制LPS诱导MMECs中Bcl-2、Bcl-xL抗凋亡基因蛋白水平和/或mRNA水平的升高,抑制Bax、Bak、Caspase-3和Caspase-8等促凋亡基因蛋白和/或mRNA水平的表达,具有抑制MMECs凋亡发挥对MMECs炎症抑制作用。总之,本研究首次报道了靛玉红抑制LPS诱导的乳腺炎的TLR4信号通路、NF-κB信号通路、MAPK信号通路和凋亡相关通路,解析了IL-1β、IL-6、TNF-α和COX-2的抑制机制,并阐述了靛玉红抑制乳腺炎的发生机理,为将来靛玉红用于奶牛乳腺炎及相关炎症疾病的防治奠定理论基础。
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【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S853.74

【参考文献】

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本文编号：1703141