皮寒药对金黄色葡萄球菌的抑制作用及其抑菌机制研究

发布时间：2018-04-14 10:07

本文选题：金黄色葡萄球菌 + 皮寒药　；参考：《西南大学》2017年硕士论文

【摘要】：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)作为一种食源性致病菌,不仅严重威胁着食品卫生安全,而且在动物生产上也具有严重的危害性。在医学和兽医学临床上,金葡菌往往引起人类和动物化脓性感染。随着耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicilin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)临床检出率不断升高,由其引起的感染现已成为全球性的卫生难题。从天然药物中寻找有效抗金黄色葡萄球菌的物质是近年来抗菌药物研发的一个方向。皮寒药是川滇米口袋(Gueldenstaedtia delavayi Franch)的干燥全草,《西昌中草药》记载其:“全草入药,四季可采;性寒,味辛苦,清热解毒、镇痛”,是四川攀西地区特色药用资源,在当地该药主要用于消除外感疾病,具有药食两用的价值。迄今,对皮寒药的研究报道较少,仅对其药效学和活性成分进行了部分研究。本课题通过提取分离皮寒药不同部位药物,以金黄色葡萄球菌为研究对象,筛选皮寒药抑制金黄色葡萄球菌生长的有效部位,并研究皮寒药有效部位抗菌作用机理。主要试验结果及结论如下:1.皮寒药几种不同部位对金黄色葡萄球菌抑菌活性研究利用有机溶剂石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分离提取皮寒药不同部位,采用微量肉汤稀释法测定皮寒药不同部位对金葡菌质控菌株ATCC25923和甲氧西林敏感金葡菌(Methicilin-susceptible Staphylococcu saureus,MSSA)临床分离株RC-1、RC-3、RC-5及耐甲氧西林金葡菌临床分离株DZ-1的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。结果表明,皮寒药正丁醇部位和水相部位对金葡菌生长无明显影响。石油醚部位和乙酸乙酯部位均能不同程度抑制金葡菌质控菌株和临床分离株的生长,其MIC分别为15 mg·mL-1和7.5 mg·mL-1,MBC分别为30 mg·mL-1和15 mg·mL-1,结果显示皮寒药乙酸乙酯部位具有更好的抑菌活性。通过对皮寒药乙酸乙酯部位几种不同浓度药物下金葡菌在不同时间点的菌落计数,绘制金葡菌的生长曲线,试验发现1 MIC药物组菌液浓度在2、4、6、10、24 h五个时间点极显著低于菌液对照组和1/4 MIC药物组(P0.01),在4、6、10、24 h四个时间点,极显著低于1/2 MIC药物组。1/2倍MIC药物组菌液浓度在2、4、6、10 h四个时间点极显著低于菌液对照组(P0.01),在2、4、6 h极显著低于1/4 MIC组。1/4倍MIC药物组菌液浓度在2、4、10 h三个时间点显著低于菌液对照组(P0.01)。结果提示:皮寒药石油醚部位和乙酸乙酯部位能抑制MSSA和MRSA的生长,与石油醚部位相比,乙酸乙酯部位显示出更好的抑菌活性,且抑菌效果与药物浓度呈正相关。2.皮寒药乙酸乙酯部位对金黄色葡萄球菌抑菌机理研究通过测定金葡菌胞外碱性磷酸酶含量、培养液电导率、葡萄糖含量变化、糖代谢相关酶活及菌体可溶性蛋白含量变化,从皮寒药乙酸乙酯部位对菌体细胞壁膜通透性、能量代谢、可溶性蛋白质合成三个方面研究药物对金葡菌的抑菌机理。结果显示,MBC药物浓度下,金葡菌培养液电导率不发生变化,胞外碱性磷酸酶活性在药物处理后1 h和3 h内显著高于菌液对照组(P0.05)。结果表明皮寒药乙酸乙酯部位对金葡菌细胞膜渗透性无影响,在药物作用前期,可增大细胞壁的通透性。对葡萄糖含量变化测定结果显示,1 MIC、1/2 MIC和1/4 MIC药物浓度组培养液中所剩葡萄糖含量在4 h、6 h、8 h显著高于0 MIC(P0.01)。0 MIC组金葡菌在6 h内消耗完培养液中的葡萄糖,而1/2 MIC和1/4 MIC组在10 h后消耗完毕,1 MIC组10 h后培养液中仍含有葡萄糖。结果表明皮寒药乙酸乙酯部位的1 MIC、1/2 MIC和1/4 MIC三个药物浓度能显著抑制金葡菌对葡萄糖的利用。对糖代谢相关酶活的检测结果显示,在第1 h、3 h、5 h三个时间点1 MIC药物组琥珀酸脱氢酶和乳酸脱氢酶活性均低于0 MIC组,其中乳酸脱氢酶活性在这两组间差异极显著(P0.01),琥珀酸脱氢酶活性在第1 h和3 h两个时间点两组间差异极显著(P0.01)。结果表明皮寒药乙酸乙酯部位1 MIC浓度药物可极显著抑制金葡菌乳酸脱氢酶和琥珀酸脱氢酶的活性。对金葡菌可溶性蛋白含量的检测结果显示,在3 h、5 h、7 h三个检测时间点,1 MIC药物组金葡菌可溶性蛋白浓度均低于菌液对照组,在3 h、5 h两个检测时间点差异极显著(p0.01),在第7 h差异显著(p0.05)。第3 h,1 MIC组菌体可溶性蛋白浓度比菌液对照组降低了42.54%,第5 h降低了17.78%,第7 h降低了15.87%。结果表明皮寒药乙酸乙酯部位1 MIC浓度药物能抑制金葡菌可溶性蛋白质的表达。试验结果提示:皮寒药乙酸乙酯部位能干扰金葡菌的能量代谢过程和可溶性蛋白质的表达,在药物作用前期能影响菌体细胞壁通透性。3.皮寒药乙酸乙酯部位对金黄色葡萄球菌抑制作用的转录组学分析本研究通过对皮寒药乙酸乙酯部位作用组和正常对照组的金葡菌转录本信息进行测序比较,结果共获得195个差异表达基因(FC≥2,P0.05),与对照组相比,皮寒药作用组金葡菌转录本中101个基因表达上调,94个基因表达下调。其中皮寒药作用组金葡菌的蛋白质合成相关基因:50S核糖体蛋白质L27、50S核糖体蛋白质L25、50S核糖体蛋白L15、核糖体RNA大亚基甲基转移酶、延伸因子G基因表达显著下调(P0.05)。有14个差异表达基因显著富集在氨基酸生物合成过程,其中5个与天冬氨酸盐家族氨基酸生物合成过程有关,基因lysC(编码天冬氨酸激酶)、thrC(编码苏氨酸合酶)、metE(编码同型半胱氨酸-S-甲基转移酶)、dapH(编码N-琥珀酰转移酶)表达上调,基因lysA(编码二氨基二庚酸脱羧酶)表达下调。嘌呤生物合成过程中,编码次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因、脱氧鸟苷激酶基因、甘氨酸连接酶基因表达下调,同时,催化嘌呤核苷磷酸解反应的嘌呤核苷磷酸化酶基因表达上调。此外,叶酸生物合成过程中聚谷氨酸合成酶、嘧啶代谢过程中的嘧啶核苷磷酸化酶基因均表达下调。测序结果显示差异基因在果糖-甘露糖代谢途径存在显著富集,果糖-二磷酸醛缩酶和L-艾杜糖醇-2-脱氢酶基因表达下调。ABC转运家族成员亚精胺/腐胺ABC转运蛋白、寡肽ABC转运蛋白、铁复合物转运蛋白、铁/锌/锰/铜转运蛋白、镍转运蛋白、磷壁酸转运蛋白的跨膜通道蛋白基因表达上调。细胞壁合成相关基因,mrcA(编码青霉素结合蛋白1A)、murB(编码UDP-N-乙酰胞壁酸脱氢酶)、sgtA(转糖苷酶基因)、tagB(编码磷壁酸生物合成蛋白质)表达上调。此外,多种毒力因子:表皮剥脱毒素A(Exfoliative toxin A)、凝集因子(Clumping factor)、杀白细胞素(Pantonvalentine leucocidin,PVL)以及与多糖细胞间黏附素(Polysaccharide intercellular adhesion,PIA)形成具有密切联系的icaR、icaC基因均表达下调。以荧光定量PCR对10个差异表达的基因进行验证。结果显示这些基因的表达变化趋势与转录组测序分析结果基本一致。试验结果表明皮寒药作用于金葡菌1 h,差异表达基因主要集中在代谢过程、催化活性、细胞过程、蛋白结合和毒力因子表达上。提示皮寒药可下调金葡菌相关毒力因子的表达,上调细胞壁合成相关基因的表达,影响氨基酸代谢、糖代谢、嘌呤嘧啶代谢过程相关酶基因的表达,并可能通过下调金葡菌核糖体相关编码基因及延伸因子的基因表达干扰菌体细胞蛋白质的合成过程。综上,本研究表明皮寒药乙酸乙酯部位对金葡菌具有抑菌和杀菌活性,可通过干扰金葡菌能量代谢过程和可溶性蛋白质的表达,抑制金葡菌的正常生长和繁殖。转录组测序结果表明皮寒药作用下,金葡菌差异表达基因主要集中在代谢过程,催化活性、细胞过程、蛋白结合和毒力因子表达上,皮寒药对金葡菌的抑制作用可能与这些基因表达的显著性变化有关。
[Abstract]:Staphylococcus aureus is a kind of food - borne pathogenic bacteria , not only threatens food hygiene safety seriously , but also has serious harm in animal production . In medicine and veterinary medicine , Staphylococcus aureus often causes infection of human and animal pyogenic infection . With the clinical detection rate of Methicilin - resistant Staphylococcus aureus ( MRSA ) , it has become a global health problem . The minimal inhibitory concentration ( MIC ) and minimal bactericidal concentration ( MBC ) of Staphylococcus aureus were studied . The results and conclusions were as follows : 1 . The concentration of bacterial solution at 2 , 4 , 6 , 10 h was significantly lower than that of control group and 1 / 4 MIC group ( P0.01 ) . The concentration of MIC in the group of 2 , 4 , 6 , 10 h was significantly lower than that of control group ( P0.01 ) . The results showed that the concentration of 1 MIC , 1 / 2 MIC and 1 / 4 MIC in 1 MIC , 1 / 2 MIC and 1 / 4 MIC group were significantly higher than that of control group ( P0.01 ) . The results showed that the expression of the gene was down - regulated by the expression of the gene lysC ( coded aspartate kinase ) , thrC ( coded threonine synthase ) , metE ( coding homocysteic - S - methyl transferase ) , gene lysA ( coded N - succinyltransferase ) , metE ( coding homocysteic - S - methyl transferase ) , gene lysA ( coded N - succinyltransferase ) .

【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S853.7

【参考文献】