鸭疫里默氏杆菌hemophore的发现及作为抗菌靶点的探索

发布时间：2017-03-23 16:06

  本文关键词：鸭疫里默氏杆菌hemophore的发现及作为抗菌靶点的探索，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：细菌铁和血红素(heme)的利用是当前抗菌研究的热点。本研究针对鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer, RA)血红素转运系统,发现并鉴定了一种胞外的heme绑定蛋白hemophore。随后,通过生物信息学分析查找到了一个潜在编码hemophore蛋白的基因家族,我们选取其中一条基因并对其进行了克隆、原核表达、纯化及功能鉴定。最后,为达到抗菌目的,我们根据hemophore具有靶向转运heme的特点,找到了一种类似heme的药物SDNS (C32H22N6Na2O6S2),并初步探索了其在抗RA中的作用。本文主要试验结果如下：1鸭疫里默氏杆菌胞外heme绑定蛋白hemophore的发现及鉴定由于细菌血红素转运系统相关蛋白的表达受环境中铁离子或血红素浓度的调节,我们试图通过在铁离子限制性液体培养基或含血红素的液体培养基中提取RA的分泌蛋白,并鉴定其中是否含有heme绑定蛋白。结果我们在含血红素的LB液体培养基中通过TCA沉淀法提取到了一种小分子的heme绑定蛋白,而在铁离子限制性的TSB培养基中并没有提取到。说明此蛋白的表达是受环境中血红素的调控而不受铁离子的调控。随后,我们进一步利用血红素琼脂糖去捕获分泌物中的heme绑定蛋白。结果同样验证了该蛋白的存在。通过以上试验,表明鸭疫里默氏杆菌可编码并分泌胞外heme绑定蛋白,我们命名为鸭疫里默氏杆菌hemophore。2鸭疫里默氏杆菌编码潜在的hemophore由于鸭疫里默氏杆菌可分泌hemophore蛋白,我们试图通过生物信息学分析的方法去发现编码hemophore蛋白的基因。结果我们发现,在鸭疫里默氏杆菌RA-GD株基因组注释中有一条被注释为"extracellular heme-binding protein"的基因,可能为潜在的hemophore基因。通过序列比对,我们发现该基因及其同源基因在已测序的4株鸭疫里默氏杆菌中均有编码且存在一个基因家族。该基因家族包括3个基因,我们分别命名为hemophore1、hemophore2、hemophore3,它们之间序列相似性在70%以上。除RA-CH-1只编码hemophore 1、hemophore2且为双拷贝外,其余3株鸭疫里默氏杆菌均编码hemophore1、hemophore2、hemophore3且为单拷贝。信号肽预测显示该家族蛋白均含有信号肽,亚细胞定位预测表明该家族蛋白主要定位于细胞外。为对潜在hemophore的功能予以验证,我们对RA ATCC hemophore 1进行了克隆、原核表达和蛋白纯化。功能鉴定结果显示,hemophore 1具有绑定血红素的功能。3鸭疫里默氏杆菌hemophore可作为潜在的抗菌药物靶点鸭疫里默氏杆菌体外分离培养需要在血平板上才能生长,而在体内,血液是其感染的重要组织。因此我们推测,血液中的血红素对其生长起着至关重要的作用。通过基因组分析,我们也证明的这一点(Wang X.et al,2014)。如果我们可以阻断鸭疫里默氏杆菌对血红素的需求,我们就可以抑制该菌的生长。根据竞争性抑制的原理,我们发现了一种血红素类似物SDNS,并验证了其在体外的抑菌作用。结果表明,SDNS可以显著抑制鸭疫里默氏杆菌的生长。由于hemophore蛋白的分泌是细菌利用血红素的第一步,所以我们推测hemophore是SDNS的一个重要靶向蛋白。SDNS体内抗菌作用及安全性评价等有待进一步研究。
【关键词】：鸭疫里默氏杆菌 hemophore 血红素转运 铁 抗菌药
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-7
• 缩略词表7-13
• 第一部分 文献综述13-21
• 第一章 革兰氏阴性菌血红素转运系统及hemophore的研究进展13-21
• 1. 革兰氏阴性菌血红素转运系统13-19
• 1.1 血红素来源14-15
• 1.2 血红素摄取15-16
• 1.2.1 直接的血红素摄取15
• 1.2.2 Hemophore介导的血红素摄取15-16
• 1.3 血红素转运16-18
• 1.3.1 血红素受体16
• 1.3.2 TonB系统16-17
• 1.3.3 ABC转运体17
• 1.3.4 血红素的储存和降解17-18
• 1.4 血红素转运的调控18-19
• 1.4.1 Fur调控18
• 1.4.2 σ调控18
• 1.4.3 复合调控18-19
• 2. 革兰氏阴性菌hemophore的研究进展19-21
• 2.1 HasA型hemophore19
• 2.2 HuxA型hemophore19
• 2.3 HmuY型hemophore19-21
• 第二部分 试验部分21-68
• 第二章 鸭疫里默氏杆菌hemophore的发现与鉴定21-32
• 1 试验材料21-24
• 1.1 菌株21
• 1.2 主要试剂21-22
• 1.3 试剂配制22-23
• 1.3.1 细菌培养相关试剂配制22
• 1.3.2 蛋白电泳相关试剂配制22-23
• 1.3.3 Western-blot相关试剂配制23
• 1.3.4 其它相关试剂配制23
• 1.4 主要仪器23-24
• 2 试验方法24-26
• 2.1 鸭疫里默氏杆菌分泌蛋白的提取24
• 2.2 胞外heme绑定蛋白的鉴定24-25
• 2.3 Heme琼脂糖亲和层析25
• 2.4 野生型hemophore分泌的优化25
• 2.5 野生型hemophore稳定性的检测25-26
• 3 结果与分析26-30
• 3.1 鸭疫里默氏杆菌分泌蛋白的提取26-27
• 3.2 胞外heme绑定蛋白的鉴定27
• 3.3 Heme琼脂糖亲和层析27-28
• 3.4 野生型hemophore分泌的优化28-29
• 3.5 野生型hemophore稳定性的检测29-30
• 4 讨论30-32
• 第三章 鸭疫里默氏杆菌潜在hemophore的生物信息学分析32-44
• 1 试验材料32-33
• 1.1 主要生物信息学分析软件及在线分析工具32-33
• 2 试验方法33-34
• 2.1 潜在hemophore基因的查找33
• 2.2 BLASTN分析33
• 2.3 蛋白质疏水性分析33
• 2.4 蛋白质抗原性及表面性分析33
• 2.5 蛋白质信号肽预测33-34
• 2.6 蛋白质亚细胞定位34
• 2.7 蛋白质结构预测34
• 3 结果与分析34-43
• 3.1 鸭疫里默氏杆菌中的潜在hemophore基因34-36
• 3.2 鸭疫里默氏杆菌潜在hemophore基因家族36-38
• 3.3 蛋白质疏水性分析38-39
• 3.4 蛋白质抗原性及表面抗原分析39-40
• 3.5 蛋白质信号肽预测40
• 3.6 蛋白质亚细胞定位40-41
• 3.7 蛋白质结构预测41-43
• 4 讨论43-44
• 第四章 潜在hemophore基因的克隆、表达、蛋白纯化及其功能验证44-63
• 1 试验材料44-46
• 1.1 菌株44
• 1.2 质粒44
• 1.3 主要试剂44
• 1.4 试剂配制44-46
• 1.4.1 细菌培养相关试剂配制44-45
• 1.4.2 核酸电泳相关试剂配制45
• 1.4.3 蛋白电泳相关试剂配制45
• 1.4.4 Western blot相关试剂配制45
• 1.4.5 蛋白纯化相关试剂配制45
• 1.4.6 其它相关试剂配制45-46
• 1.5 主要仪器设备46
• 2 试验方法46-53
• 2.1 引物设计与合成46-47
• 2.2 潜在hemophore的PCR扩增47
• 2.3 PCR扩增产物的回收47-48
• 2.4 重组表达质粒的构建48-51
• 2.4.1 载体质粒的提取48
• 2.4.2 基因片段及质粒的酶切和回收48-49
• 2.4.3 连接49
• 2.4.4 感受态细胞的制备49
• 2.4.5 连接产物的转化49-50
• 2.4.6 阳性克隆的PCR鉴定50-51
• 2.4.7 阳性质粒的提取及测序51
• 2.5 表达载体的构建及表达51-52
• 2.5.1 重组质粒转入表达菌51
• 2.5.2 表达菌阳性克隆的PCR鉴定51
• 2.5.3 诱导表达51-52
• 2.5.4 重组蛋白的SDS-PAGE检测52
• 2.6 重组蛋白的纯化52-53
• 2.6.1 重组蛋白的大量表达52
• 2.6.2 蛋白纯化52-53
• 2.7 潜在hemophore的功能验证53
• 3 结果与分析53-60
• 3.1 潜在hemophore基因扩增53-54
• 3.2 PCR产物回收54
• 3.3 质粒提取54-55
• 3.4 酶切及连接55
• 3.5 转化55-57
• 3.6 PCR鉴定阳性克隆57
• 3.7 测序鉴定结果57
• 3.8 重组蛋白的诱导表达57-59
• 3.9 重组蛋白的纯化59-60
• 3.10 潜在hemophore的功能验证60
• 4 讨论60-63
• 第五章 hemophore作为抗菌靶点的探索63-68
• 1 试验材料63
• 1.1 菌株63
• 1.3 主要试剂63
• 1.4 试剂配制63
• 1.5 主要仪器63
• 2 试验方法63-64
• 2.1 SDNS最小抑菌浓度的测定64
• 2.2 抑菌生长曲线测定64
• 3 结果与分析64-66
• 4 讨论66-68
• 参考文献68-73
• 第三部分 致谢73-74
• 附录74-75
• 攻读学位期间发表的学术论文目录75

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