环境因子对微拟球藻脂质代谢及其硫脂酶转录水平的影响

发布时间：2017-03-28 05:11

  本文关键词：环境因子对微拟球藻脂质代谢及其硫脂酶转录水平的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：随着人口的增长和世界经济的飞速发展,化石能源的消耗日益加剧。为解决由此带来的能源危机和环境问题,世界各国不得不加快开发化石能源的替代燃料。近年来,生物柴油做为一种清洁可再生能源受到越来越多的重视。生物柴油虽然优点众多,但其传统原料可能会对农产品价格、粮食安全产生影响。因此,选择一种低廉的、安全的原料来生产生物柴油是发展的总趋势。微拟球藻(Nannochloropsis)属于真眼点藻纲(Eustigmatophyceae),是一类重要的单细胞经济微藻。它富含蛋白质、多不饱和脂肪酸、色素等高附加值产物,且光合效率高、环境适应性强,油脂含量可以达到细胞干重的30%,能够进行大规模培养,被认为是生产生物柴油颇具前景的原料。尽管微藻做为生物柴油的原料有其它原料不可比拟的优势,但天然微藻脂肪酸的饱和度和长度并不适合生物柴油的生产。近年来,通过改变培养基组成、控制培养条件以及基因工程法提高微藻油脂含量和脂肪酸质量成为生物柴油研究的热点。实验包括以下两个部分：第一部分：分析微拟球藻cDNA文库,从微拟球藻中分离出一条硫脂酶基因的cDNA全长,命名为NoTE。NoTE全长1,314 bp,编码437个氨基酸,蛋白质相对分子质量为55 kD。将该基因连接到原核表达载体pET-30a上,转入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达进行功能的初步验证。实验结果显示,表达NoTE并未改变大肠杆菌的脂肪酸组成,但其C14:1、C16:0、C16:1、C18:1及总脂肪酸含量较不含重组质粒菌株分别提高了11%、18%、32%、49%和30%,证明克隆的硫脂酶基因能在大肠杆菌中表达并具有相应的酶活性。第二部分：探究了限氮、限磷及不同温度对NoTE转录水平及微拟球藻总脂含量、脂肪酸组成的影响。限氮处理组结果显示,NoTE转录水平及油脂含量随限氮时间的延长而提高；在对脂肪酸组成的影响上,氮缺乏可以抑制多不饱和脂肪酸的合成,促进饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸的合成。限磷处理得到了与限氮处理相同的结论。温度处理组结果显示,随温度的提高NoTE转录水平逐步提高,在20℃时油脂含量最高,在实验温度范围内,高温促进饱和脂肪酸的合成。综上所述,本研究成功分离了微拟球藻一条硫脂酶基因,通过原核表达体系验证了其功能；进一步探索了环境因子对该基因转录水平以及对微拟球藻油脂含量和脂肪酸组成的影响。
【关键词】：生物柴油 微拟球藻 硫脂酶 环境因子
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S917.3
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第一章 文献综述12-24
• 1 生物柴油12-14
• 1.1 生物柴油概述及其研究现状12
• 1.2 微藻生物柴油的优势及研究进展12-14
• 2 影响微藻总脂含量和脂肪酸组成的环境因子14-17
• 2.1 培养基组成14-15
• 2.2 温度15-16
• 2.3 光照16
• 2.4 盐度16-17
• 3 微藻的基因工程研究17-20
• 3.1 微藻基因工程研究进展17-18
• 3.2 基因工程对微藻总脂含量和脂肪酸组成的影响18-19
• 3.3 微藻转基因的方法19-20
• 4 硫脂酶的研究进展20-24
• 4.1 硫脂酶在脂质合成中的作用20-21
• 4.2 硫脂酶的分类及底物偏好性21-22
• 4.3 硫脂酶的结构22
• 4.4 硫脂酶在基因工程育种中的应用22-24
• 第二章 微拟球藻硫脂酶基因的克隆及功能验证24-36
• 0 前言24-25
• 1 微拟球藻藻种来源及培养25
• 1.1 藻种来源25
• 1.2 藻种培养25
• 1.2.1 材料与仪器25
• 1.2.2 培养方法25
• 2 硫脂酶基因的克隆及进化分析25-31
• 2.1 材料与仪器25-26
• 2.2 方法流程26-29
• 2.2.1 微拟球藻总RNA的提取26-27
• 2.2.2 设计特异性引物获得基因全长27-29
• 2.2.3 硫脂酶基因的进化分析29
• 2.3 结果与分析29-31
• 2.3.1 RNA提取结果29-30
• 2.3.2 硫脂酶基因全长的获得及进化分析30-31
• 3 重组质粒pET30a-NoTE的构建31-33
• 3.1 材料与仪器31
• 3.2 方法流程31-32
• 3.3 结果与分析32-33
• 4 原核表达对NoTE进行功能鉴定33-35
• 4.1 材料与仪器33
• 4.2 方法流程33-34
• 4.2.1 SDS-PAGE检测硫脂酶基因在大肠杆菌中的表达33-34
• 4.2.2 气相色谱法测定重组子脂肪酸组成及含量34
• 4.3 结果与分析34-35
• 4.3.1 硫脂酶基因的表达34-35
• 4.3.2 重组子脂肪酸组成及含量测定35
• 5 讨论35-36
• 第三章 环境因子对微拟球藻NoTE转录水平、总脂含量及脂肪酸组成的影响36-57
• 0 前言36-37
• 第一节 限氮对微拟球藻NoTE转录水平、总脂含量及脂肪酸组成的影响37-45
• 1 材料与仪器37-38
• 2 培养基及培养条件38
• 3 方法流程38-40
• 3.1 藻种的培养及收集38
• 3.2 重量法(氯仿-甲醇法)测定总脂含量38-39
• 3.3 气相色谱法测定脂肪酸组成39
• 3.4 RT-PCR测定NoTE转录水平39-40
• 4 结果与分析40-43
• 4.1 限氮对微拟球藻总脂含量的影响40-41
• 4.2 限氮对微拟球藻脂肪酸组成的影响41-42
• 4.3 限氮对NoTE转录水平的影响42-43
• 4.4 NoTE转录水平与总脂含量、脂肪酸组成的相关性分析43
• 5 讨论43-45
• 第二节 限磷对微拟球藻NoTE转录水平、总脂含量及脂肪酸组成的影响45-49
• 1 材料与仪器45
• 2 培养基及培养条件45
• 3 方法流程45-46
• 3.1 藻种的培养及收集45
• 3.2 重量法(氯仿-甲醇法)测定总脂含量45-46
• 3.3 气相色谱法测定脂肪酸组成46
• 3.4 RT-PCR测定NoTE转录水平46
• 4 结果与分析46-48
• 4.1 限磷对微拟球藻总脂含量的影响46
• 4.2 限磷对微拟球藻脂肪酸组成的影响46-47
• 4.3 限磷对NoTE转录水平的影响47-48
• 4.4 NoTE转录水平与总脂含量、脂肪酸组成的相关性分析48
• 5 讨论48-49
• 第三节 温度对微拟球藻NoTE转录水平、总脂含量及脂肪酸组成的影响49-57
• 1 材料与仪器49
• 2 培养基及培养条件49-50
• 3 方法流程50-51
• 3.1 藻种的培养及收集50
• 3.2 重量法(氯仿-甲醇法)测定总脂含量50
• 3.3 气相色谱法测定脂肪酸组成50
• 3.4 RT-PCR测定NoTE转录水平50-51
• 4 结果与分析51-54
• 4.1 不同培养温度下藻细胞生长速率、比生长速率的比较51-52
• 4.2 温度对微拟球藻总脂含量的影响52-53
• 4.3 温度对微拟球藻脂肪酸组成的影响53
• 4.4 温度对NoTE转录水平的影响53-54
• 4.5 NoTE转录水平与总脂含量、脂肪酸组成的相关性分析54
• 5 讨论54-57
• 工作总结与展望57-58
• 参考文献58-68
• 个人简历68
• 已发表文章68-69
• 致谢69

【参考文献】

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本文编号：271719