猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（APP）三聚体自转运粘附素肺组织互作蛋白筛选研究

发布时间：2020-08-06 16:56

【摘要】：三聚体自转运黏附素(Trimeric autotransporter adhesins, TAAs)是许多目前已知革兰氏阴性菌外膜上具有的非常重要的黏附毒力蛋白,在细菌对机体的黏附过程、侵袭能力、定植作用、被膜形成、抵御血清和自凝功能中发挥非常重要的作用。黏附素通过与细胞表面基质或受体结合后启动胞内信号级联反应,引发机体与致病菌互作,因此细菌黏附宿主在致病菌与宿主免疫系统互作过程中具有重要作用。Adh为APP上新发现的三聚体自转运黏附素,本文对Adh基因进行肺组织文库的酵母双杂交筛选,并对筛选分析出的阳性蛋白进行生物信息学分析,且利用生物信息学相关分析结果讨论互作可能性及预测Adh其他未知功能。主要的研究内容如下：1.APP Adh基因酵母双杂交诱饵质粒构建及鉴定以NCBI公布的Adh基因序列为基础,设计引物从APP 5b型菌株中扩增Adh基因,其基因大小为1600bp左右。将Adh基因连接T克隆载体,经酶切测序鉴定正确后构建PGBKT7-Adh重组诱饵质粒,该诱饵质粒经PCR鉴定和测序验证显示,插入的Adh基因序列无移码突变,表明PGBKT7-Adh重组质粒构建成功。首先将PGBKT7-Adh重组质粒转化入酵母菌AH109感受态细胞中,筛选在SD/-Trp上能够生长的酵母菌落作PCR鉴定,结果显示1600bp左右条带,表明PGBKT7-Adh重组质粒转进酵母菌AH109中,成功构建含Adh基因的酵母双杂交诱饵质粒菌。其次鉴定诱饵质粒菌的筛选及生长特性,以空载体质粒菌为阴性对照,诱饵质粒经自激活验证试验表明转入的诱饵重组质粒不能激活报告基因对自身无自激活现象,毒性验证表明诱饵质粒菌与阴性对照生长情况一致对菌株的正常生长不产生影响,综上结果说明诱饵质粒菌能够用于后续筛选验证。2.肺组织文库(大肠杆菌及酵母菌)质量鉴定将保存的肺组织文库(大肠杆菌及酵母菌)平板培养后,首先分别挑取LB含氨苄抗性及SD/-Leu平板上的单个菌落作PCR鉴定文库质粒大小,结果显示文库条带大部分分布于1000bp左右,符合文库片段大小要求。其次对肺组织文库(大肠杆菌)容量进行鉴定,结果显示5ml的菌液总库容量为2.9×107CFU。再对肺组织文库(酵母菌)进行滴度测定和缺陷培养基生长验证,缺陷培养结果显示能够在SD/-Leu平板生长,不能在SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His平板生长,说明表型正确；滴度结果显示大于2X 107 cfu/ml,表明文库完整。结果表明保存的肺组织文库(大肠杆菌和酵母菌)质量较好,能够满足酵母双杂交筛选条件。3. APP Adh肺组织互作蛋白筛选将诱饵质粒与保存的猪肺组织cDNA文库质粒共转化入酵母菌AH109中。根据酵母双杂交筛选的缺陷生长及显色原理,共转子经SD/-Trp/-Leu平板过度后转移至SD/-His/-Ade/-Trp/-Leu/-X/-A平板。挑取在SD/-His/-Ade/-Trp/-Leu/-X/-A上生长的蓝色较大菌落,提取质粒后与诱饵质粒再次杂交作回复验证表明具有显色反应。同时对质粒进行PCR及测序验证比对。结果显示经两轮筛选,在SD/-His/-Ade/-Trp/-Leu/-X/-A平板上共获得蓝色较大酵母菌落13个,提取质粒PCR结果显示大部分质粒位于500bp左右,测序验证后经NCBI比对mRNA编码区分析结果显示筛选出四个阳性蛋白,分别为锌指蛋白,含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶,HLA-Ⅱ类分子的调节分子,支链氨基酸转氨酶1。然后分析了四种蛋白的生物学特性及功能位点,且预测Adh可能的潜在功能。本研究内容为进一步对三聚体自转运黏附素(Adh)的功能与结构联系、机体肺组织受体与功能蛋白相互反应作用以及该蛋白在入侵、致病机制中的地位作用奠定基础。
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.61

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