烟草T-DNA激活标签发育改变突变体基因克隆与功能分析

发布时间：2020-08-20 15:58

【摘要】：本研究在T-DNA激活标签插入红花大金元的突变群体中观察到一个突变株系,该突变株系较红花大金元表型有明显改变,主要表现为矮化、叶间距短。通过对突变株系侧翼序列的扩增及后续的共分离试验确定引起突变的激活标签的位置,对插入位置两侧基因表达量进行分析筛选激活基因,后续的转基因试验则进一步验证了基因的功能。通过以上研究,本文主要得到以下结果:(1)根据该株系在T2、T3代的分离情况,初步可以判断该突变表型为单基因控制的显性突变。采用FPNI技术对突变株系进行侧翼序列扩增,所得侧翼序列在烟草基因组数据库中进行序列比对。序列比对结果显示,突变体有两个插入位点,分别插入到1号染色体和10号染色体中。共分离试验结果显示,10号染色体的插入是引起突变表型的插入。株系中阳性无突变表型植株的侧翼序列扩增结果也证实了这一结论。(2)利用烟草基因组数据库,结合茄科植物数据库中信息,寻找插入位置上下游120 kb内的基因。结果显示,10号染色体在插入位点附近有5个基因,最近基因Ntab0245760距离插入位点71 kb。该基因属于多药有毒化合物排出家族。选取插入位点附近的5个基因进行相对定量PCR。相对定量的结果显示,5个基因中,Ntab0245760在突变体中的表达量明显升高,其他4个基因的表达量在红花大金元和突变体中基本无变化。初步判定Ntab0245760在突变体中的过量表达产生突变表型。(3)对Ntab0245760基因进行过表达载体的构建,转化红花大金元。对转基因苗进行阳性鉴定及表达分析。转基因阳性苗与对照植株相比,不同程度的表现出突变株系的突变表型。对转基因植株Ntab0245760基因的相对定量结果还显示,转基因植株相较于阴性对照,Ntab0245760基因的表达量明显提高,且Ntab0245760基因的表达量越高,突变性状越显著。这进一步证明了Ntab0245760在突变体中的过量表达产生突变表型。(4)结合茄科植物数据库中普通烟草基因组信息,利用生物信息学方法预测烟草基因组中MATE家族成员,初步预测到131个MATE基因。它们分为4个亚家族,亚家族3成员与其他MATE基因亲缘关系较远。Ntab0245760属于亚家族4成员,与拟南芥At ZRZ、At ADP1的亲缘关系较近。以往研究报道中,At ZRZ、At ADP1的过表达都能引起与突变株系相似的突变表型,At ADP1还被证明与生长素的生物合成相关,而突变株中生长素含量降低的现象表明,Ntab0245760很可能与At ADP1有着相似的功能。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S572;Q943.2

【参考文献】