动物源性肠球菌多位点序列分型及质粒检测

发布时间：2017-04-03 21:00

  本文关键词：动物源性肠球菌多位点序列分型及质粒检测，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：肠球菌是一类球形或卵圆形,不形成芽孢,常以成对或短链形式存在的需氧或兼性厌氧的革兰氏阳性球菌,且为条件性致病菌,广泛存在于水、土壤等环境中,是人和动物体胃肠道正常菌群之一,粪肠球菌和屎肠球菌是其优势菌种。临床上由于抗生素的滥用,多重耐药菌株的出现,使肠球菌的感染率不断上升,成为感染的要病原菌。虽然肠球菌被习惯性认为肠球菌是人和动物肠道共生的条件性致病菌,但它们能获得特定的遗传性状,如毒力和耐药性等因素,这也提高了其在复杂环境中的适应能力,使得许多耐药菌株大量出现和蔓延。肠球菌对现有的大多数抗菌药物天然耐药(如青霉素类、头孢类抗菌药物),使其不易从感染部位清除。肠球菌易通过点突变和移动遗传因素获得耐药性,最常见的方式是接合或者通过质粒的水平传输或转座子。有研究表明几个确定质粒无论是位点特异性重组或同源重组转座子能共转移和整合进染色体中。肠球菌中质粒的流行性和重要性在动物、食品和人的野生型肠球菌耐药性的传播中具有重要作用是未知的。质粒是可塑的和动态结构,它常被认为不同的特定功能如维护(复制,稳定性和拷贝数控制),转让(移动和转移),致病性(致病岛和毒力基因),降解途径(生化特性)和抗性功能(抗微生物,重金属)。最近的一些研究表明,这些模块进化中保留该宿主特异性。目前,国外对肠球菌致病性的研究较多,而国内则较少。由于细菌的进化与所处环境有着非常密切的关系,所以不同地区的菌株会有着自身的特点,然而关于肠球菌的流行病学和种群结构知道很少。本研究以90株不同来源肠球菌分离株为研究对象,应用多位点序列分型(MLST)技术,根据GenBank公布的肠球菌基因组上7个不同管家基因设计特异性引物,粪肠球菌gdh葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、gyd甘油醛-3-磷酸脱氢酶、pstS磷酸ATP结合盒转运、gik葡萄糖激酶、aroE草酸-5-脱氢酶、xpt黄嘌呤磷酸、yiqL乙酰-CoA乙酰转移酶;adk(腺苷酸激酶),atpA(ATP合成酶,α亚基),ddl(D-丙氨酸连接酶),gyd(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、pstS(磷酸ATP结合盒转运体、purK(烯醇丙酮酸羧化酶ATP酶亚基)。以不同来源的肠球菌DNA为模板,通过PCR扩增出各个管家基因,经胶回收纯化,送公司进行测序,测序正确的进行数据分析得到等位基因图谱,构建等位基因图谱并确立序列型(STs),进而对90株肠球菌进行分型,系统分析菌株间的系统发育进化关系。然后进行菌群结构调查和菌群遗传分析及流行病学分析。MLST结果分析表明肠球菌共54个ST型,其中粪肠球菌和屎肠球菌各占27个ST型。粪肠球菌主要分布在ST16有9株;ST163、ST238和ST631分别4株;ST69、ST138、ST330、ST363、ST597分别有3株,其余各ST型到只包含1或2株菌。屎肠球菌主要分布ST178、ST190分别有2株菌,其余如ST22、ST26等各个ST仅仅包含1株菌。随后为研究肠球菌其质粒携带情况,来自肠球菌公布的12种质粒序列,根据其复制起始基因(rep)进行序列比对,使用其蛋白和DNA水平80%的一致性,设计引物,摸索不同质粒的PCR条件,每个质粒在所测菌株中进行试验多次筛选直到有菌株中出现某种质粒,然后送公司测序,将序列正确的作为阳性质粒,再对其它菌株进行检测。如果某种质粒在所测菌株中均没有出现,在本实验中暂定为阴性。本研究对不同来源的65株肠球菌进行质粒流行性测试结果表明,rep9家族在粪肠球菌中最普遍,而rep2在是屎肠球菌中最常见;65株粪肠球菌中有8株检测到质粒,所检测出的质粒分别是pIP501(分离株N9、N41),pRE25(N1、N5、20a),pAM373(N5、N10)和pS86(N2、N4),并且分离株N5中携带了两种质粒。上述结果说明动物源性肠球菌分离株中存在质粒,但携带数量数量较少。由于条件所限上述结果尚需要进一步的研究加以证实。
【关键词】：肠球菌 MLST 测序 质粒
【学位授予单位】：河南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.611
【目录】：

• 致谢4-6
• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 常用缩略词11-12
• 文献综述12-26
• 1.肠球菌概述12-18
• 2.肠球菌的分子生物学鉴定18-22
• 3.肠球菌质粒鉴定的研究22-26
• 试验一 动物源性肠球菌MLST检测26-42
• 1 材料26-28
• 2.方法28-31
• 3.结果与分析31-40
• 4．讨论40-42
• 试验二 肠球菌的质粒检测42-52
• 1 材料42-44
• 2.方法44-48
• 3．结果与分析48-50
• 4．讨论50-52
• 结论52-53
• 参考文献53-61
• 发表论文61

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 蒋伟;黎满香;林荣高;田世成;;肠球菌研究进展[J];动物医学进展;2011年05期

2 王亚宾;张祥;胡清林;孟振北;陈丽颖;陈小丽;崔保安;;仔猪关节炎粪肠球菌生物学特性研究[J];河南农业大学学报;2011年02期

3 俞道进;尹兵;易秀丽;马玉芳;李健;黄一帆;;猪源万古霉素耐药肠球菌分离及表型和基因型检测[J];畜牧兽医学报;2011年02期

4 文静;孙建安;周绪霞;李卫芬;;屎肠球菌对仔猪生长性能、免疫和抗氧化功能的影响[J];浙江农业学报;2011年01期

5 康孟佼;朱春红;蒋颖;姚丰华;吴娟;段小丽;朱国强;;肠炎沙门菌间接ELISA检测方法的建立[J];中国家禽;2010年15期

6 王东;唐铭坤;黄震;周芳永;周霞;;致羔羊脑炎粪肠球菌聚集物质Asa1基因的克隆与序列分析[J];畜牧与兽医;2010年05期

7 王中强;邱少富;王勇;孙岩松;宋宏彬;;多位点序列分型技术及其研究进展[J];军事医学科学院院刊;2010年01期

8 周霞;王晓兰;剡根强;马勋;;肠球菌研究进展[J];石河子大学学报(自然科学版);2008年06期

9 周霞;王晓兰;剡根强;马勋;;粪肠球菌抗体间接ELISA检测方法的建立及应用[J];中国兽医科学;2008年05期

10 刘金华;贺丹;杨艳秋;张波;王丽;;多位点测序分型技术在病原微生物分型鉴定中的应用[J];微生物学通报;2007年06期

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本文编号：284936