鸡传染性支气管炎病毒Sczy3株细胞适应株的培育及其免疫效力的评价

发布时间：2020-10-29 23:05

　　 鸡传染性支气管炎(infectious bronchitis, IB)是鸡的一种急性高度接触性呼吸道传染病,由鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus, IBV)导致。该病毒具有高度变异性,血清型众多,且不同血清型之间仅有部分交叉反应甚至不存在交叉反应性。国内外主要采用弱毒疫苗接种对JB进行预防,但现有的传统疫苗对目前流行毒株仅能提供部分免疫保护。因此,为制定有效的免疫程序和为鸡群提供坚实的保护,应选择地方分离毒株或与流行毒株同一血清型毒株研制的疫苗。Sczy3是本实验室于2009年分离的一株LX4型的IBV毒株,利用鸡胚肾细胞(CEK)将其连续传至100代(C100)以致弱,希望制备出一株IB弱毒疫苗的候选株。试验结果显示：毒株在CEK细胞传代过程中,毒株能够高度适应CEK细胞,并能出现合胞体、空斑等典型病变。此后,将C]00代毒接种后非免疫雏鸡群未见临床发病症状,发病率和死亡率均为0%,这说明Sczy3毒株在CEK细胞连续传至C100代时已充分致弱。通过荧光定量PCR检测发现,不同代次的病毒在CEK细胞中CEK内增殖变化曲线呈单峰状,接毒后12-36h时是病毒增殖的高峰期,并于36h病毒滴度达到最高,但从接毒后36h至72h内病毒滴度则逐渐降低。在CEK细胞中大致传10代,Sczy3即可适应细胞,且病毒滴度逐渐升高,但在感染CEK细胞36h时,则呈现出早期代次的Sczy3病毒滴度要高于中、晚期代次的病毒滴度(病毒滴度：C20C50C90)。为评价Sczy3 C100对同源毒株及当前流行毒株的免疫保护效力。采用Sczy3C100、4/91和H120商品化疫苗分别接种7日龄的非免疫雏鸡,经二免后2周分别用Sczy3P3和SCTW分离株进行攻毒,统计各试验组鸡群抗体效价、攻毒后临诊症状、气管和肾脏的带毒情况等指标。结果显示：免疫组鸡群免疫后抗体效价均为阳性,Sczy3 C100对同源毒株可提供有效免疫保护；而对不同基因型毒株SCTW可提供一定临床保护,但鸡群气管和肾脏的病毒检出率稍高于Sczy3 P3攻毒组。目前我国有众多的IBV基因型流行,故而IBV新疫苗的研究任重道远。
【学位单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S852.65
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一部分 文献综述和选题目的意义
    1 概论
        1.1 流行概况
        1.2 病原学
            1.2.1 病原分类
            1.2.2 IBV病毒粒子结构
            1.2.3 生物学特性
        1.3 IBV的基因结构
        1.4 结构蛋白
        1.5 IBV的遗传变异机制
        1.6 培养特性
    2 IB疫苗研究进展
        2.1 IB灭活疫苗
        2.2 IB弱毒疫苗
        2.3 IB亚单位疫苗
        2.4 IB载体疫苗
        2.5 IB DNA疫苗
    3 荧光定量PCR研究进展
    4 实验目的及意义
第二部分 试验内容
    试验一 鸡传染性支气管炎病毒SCZY3细胞适应株的培育
        1 材料
            1.1 实验动物、鸡胚和鸡红细胞
            1.2 毒株与菌株
            1.3 主要仪器
            1.4 主要试剂和试剂盒
            1.5 试剂的配制
            1.6 引物的设计
        2 方法
            2.1 Sczy3细胞适应株的培育及传代
            2.2 鸡红细胞凝集实验
            2.3 病毒滴度测定
            2.4 Sczy3细胞适应毒株的致弱评价
            2.5 遗传稳定性和毒力稳定性
                2.5.1 细胞水平检测
                2.5.2 动物水平检测
        3 结果
            3.1 IBV Sczy3在CEK细胞上的适应
            3.2 细胞上清液对鸡红细胞的凝集活性
            3.3 病毒滴度的测定
            3.4 不同代次IBV Sczy3 CEK细胞适应毒的致弱评价
            3.5 遗传稳定性和毒力稳定性评价结果
                3.5.1 不同代次细胞适应株NP基因的RT-PCR测定
                3.5.2 Sczy3C100的毒力返强测定
        4 讨论
            4.1 关于CEK细胞的培养
            4.2 关于IBV Sczy3在CEK细胞上的适应
            4.3 关于IBV Sczy3的病毒滴度
            4.4 关于IBV Sczy3的致弱
            4.5 关于IBV Sczy3的稳定性
    试验二 建立荧光定量RT-PCR方法对IBV SCZY3 CEK细胞适应株的增殖规律进行研究
        1 材料
            1.1 试剂
            1.2 试剂
            1.3 荧光定量PCR引物的设计
        2 方法
            2.1 病毒RNA提取与cDNA的合成
            2.2 N基因质粒标准品的制备
            2.3 荧光定量RT-PCR反应体系和条件的优化
            2.4 标准曲线的建立
            2.5 敏感性试验
            2.6 重复性检验
            2.7 应用荧光定量PCR检测研究Sczy3细胞适应株的增殖特点
                2.7.1 比较Sczy3细胞适应株在CEK细胞内不同感染时间的病毒量
                2.7.2 比较不同代次的Sczy3细胞适应株在不同感染时间CEK细胞的病毒核酸拷贝数
        3 结果
            3.1 检测IBV的荧光定量PCR方法的建立
                3.1.1 质粒浓度的测定
                3.1.2 建立荧光定量RT-PCR的反应程序与反应体系
                3.1.3 标准曲线的建立
                3.1.4 敏感性试验结果
                3.1.5 重复性试验结果
            3.2 IBV Sczy3在CEK上的增殖规律的研究
        4 讨论
    实验三 SCZY3 C100免疫保护效力的评价
        1 材料
            1.1 试验动物
            1.2 毒株
            1.3 常用试剂和试剂盒
        2 方法
            2.1 攻毒毒株病毒滴度的测定
            2.2 试验设计
            2.3 样品的采集
            2.4 样品病毒的分离
            2.5 间接ELISA检测抗体
        3 结果
            3.1 攻毒毒株病毒滴度的测定
            3.2 Sczy3 C 100免疫保护效力的评价
                3.2.1 发病鸡临诊症状、发病率及死亡率
                3.2.2 血清抗体变化及病毒分离结果
        4 讨论
结论
参考文献
致谢

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本文编号：2861594