大白菜抗根肿病基因BraA.PB.1.2与BraA.Pb.8.2的初步定位

发布时间：2020-10-31 12:39

　　 大白菜是十字花科芸薹属植物,最早起源于中国,是中国种植面积最大的蔬菜作物,在人民的生活中有十分巨大的食用价值和营养价值。十字花科根肿病是由根肿菌Plasmodiophora brasicae Woronin引起的一种土传病害,对各种十字花科作物有致命的伤害,是世界上对芸薹作物的重要疾病之一。该病传播迅速,目前对各种各样的十字花科蔬菜生产构成了严重威胁,尤其是对大白菜的品质及产量影响非常巨大。随着我国大白菜种植面积的增加,根肿病的侵害也越来越严重,挖掘新的抗性基因,转育出新的抗病品种是目前最有效的也是最直接的防治根肿病的方式。经过数年的接种鉴定,CR026是对根肿病有非常良好的抗性的大白菜品种,为了明确其抗病基因,开发连锁标记,本研究用高感大白菜自交品种17A12A与CR026进行杂交得到F_1代,经过F_1代自交得到F_2代,对F_2代进行接菌鉴定,选择20棵极端抗病单株,20棵极端感病单株,利用BSA(分离群体分组分析)法建立抗病池和感病池,用653对SSR、Indel和SNP标记对其进行筛选。179棵F_2代植株自交得到179个F_(2:3)家系,使用分子标记与接菌表型进行筛选,最终获得了与抗根肿病紧密连锁的分子标记,对抗病基因进行了初步定位。得到以下结果:1、对72棵F_1代进行接菌鉴定,发现F_1代表现为感病,F_1代自交得到F_2代,在F_2代表现出抗感分离。利用BSA重测序发现,在A01与A08染色体上存在明显的变异位点。再用179个F_(2:3)家系接菌,通过接菌结果发现F_2的抗病与感病的比例为R∶S=12∶167,卡方检验χ~2=0.0625.99符合1:15的分离比,因此推断根肿病抗性由两个互为独立隐性基因控制,并将A01染色体上的位点命名为BraA.PB.1.2,将A08染色体上的位点命名为BraA.Pb.8.2。2、对179个F_(2:3)家系进行分子标记筛选,在653对引物中,有多态性的引物共113对,其中A01染色体上有17对,A08上有20对,在A01染色体上有6个SSR标记与抗病基因连锁,上游分别为C230、C228和C141,下游分别为ACMP473、C234和ACMP334,其中两个最近的侧翼标记为C230与ACMP473遗传距离为4.9 cM,物理距离为0.44 Mb。在A08染色体上有2个SSR标记和3个SNP标记与抗病基因连锁,上游分别为S044、C353,下游分别为A08-107、A08-108、A08-106。两个最近的侧翼标记遗传距离为11.8 cM,物理距离为2.09 Mb。3、通过对F_(2:3)家系的基因型和表型联合分析发现,当两个基因都是纯合时,植株表现为绝对抗病;当BraA.PB.1.2纯合BraA.Pb.8.2杂合时或者BraA.PB.1.2杂合BraA.Pb.8.2纯合时抗病性较差,两个基因型杂合或者为感病基因型时则完全感病。再经过85棵F_2抗病植株与96棵感病植株的基因型与表型验证,发现结果与上述一致,因此证明了两个基因为隐性纯合抗病基因,并且为功能互补、独立遗传两个抗病基因。综上所诉,本研究通过构建了F_2代群体,进一步获得了F_(2:3)家系,使用韩国KEL23根肿菌进行接种,完成了对抗病品种CR026中含有的抗根肿病基因的初步定位,开发并验证了与BraA.PB.1.2、BraA.Pb.8.2基因紧密联锁的分子标记,这些标记可以应用到大白菜抗根肿病的选择中,提供了新的抗源,为今后进一步研究抗病基因的分子功能奠定基础。
【学位单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：S436.341.1
【部分图文】：

沈阳农业大学硕士学位论文19医用5ml注射器，以上器具使用前均灭菌处理，每穴播一棵苗，当苗长出两片子叶时，进行接菌，每棵苗接菌1ml，直接注射到小苗的根部，保证接菌质量，接菌前控水，避免稀释菌液，影响接菌效果。c)表型鉴定：接菌45天后进行表型鉴定，45天内，控制湿度在70%～90%内，提高发病率。根肿菌数个/毫升=80小格内根肿菌个数/80×400×104×稀释倍数2.2.2表型鉴定与分级标准接菌45天后进行表型鉴定。2018年上半年对72棵F1进行接菌鉴定，使用36棵91-12做接菌对照；2018年下半年选择其中979棵F2用来做接菌鉴定，使用72棵91-12做接菌对照；2019年下半年对179棵F2:3家系进行接菌表型鉴定，每个家系每次接菌20棵，每个穴盘播3个家系，用12棵91-12做对照，两次重复。分级标准采用Buczacki等在1975年的分级方法。将发病等级分为0～3级，0级根部发达，无根瘤产生；1级主根无瘤，侧根小瘤；2级主根小瘤，侧根肿瘤较大；3级主根侧根均有大瘤产生，植株萎蔫（如图1-1）。0级为抗病，1、2、3级为感病（Buczackietal.，1975）。注：发病指数=(∑（各级发病株数×相应等级数）)/调查的总株数图1-1接菌鉴定分级情况Figure1-1Inoculationidentificationandclassification

三、结果与分析26图3-1F2:3家系抗病性鉴定Figure3-1DiseaseresistanceidentificationofF2:3families3.2BSA数据的分析与结果3.2.1BSA数据质控测序项目在Illumina测序平台上完成，测序数据包含一些带接头（adapter）、低质量的reads，为了防止这些序列对后续的信息分析产生过多得干扰，对后续信息分析的质量和准确性提供保证，需要对测序数据进行进一步过滤。主要从以下几点进行数据过滤：a)接头污染去除。去除3’端的接头污染，至少10bpoverlap（AGATCGGAAG），允许20%的碱基错误率；b)reads过滤。去除含N（N表示无法确定碱基信息）较多（≥10%）的reads；c)质量过滤。去除低质量的序列（Q≤10的碱基占整体序列碱基数目的50%以上，即认为是低质量的序列）。本研究中候选位点的筛选综合了SNPindex和G_Stats的结果，对他们选取一定的阈值，筛选共同的显著位点作为候选位点。其中SNPIndex的阈值设置为0.95，G_Stats的阈值设置为Top0.1%（即所有位点中0.1%的位点认为是显著的）3.2.2BSA测序定位BraA.PB.1.2与BraA.Pb.8.2基因本研究中候选位点的筛选综合了SNPindex和G_Stats（图3-2）的结果，对抗病性鉴定

沈阳农业大学硕士学位论文27他们选取一定的阈值，筛选共同的显著位点作为候选位点。其中SNPIndex的阈值设置为0.95，G_Stats的阈值设置为Top0.1%（即所有位点中0.1%的位点认为是显著的）。通过两个标准共同筛选，共有6720个位点被筛选出来，变异位点在A08染色体上存在数目最多且有一处密度最高，在A01染色体上变异位点较少，但有一处密度较高。图3-2样本间G_Stats值在染色体上的分布Figure3-2DistributionofG_Statsonchromosomesbetweensamples3.3BraA.PB.1.2与BraA.Pb.8.2基因遗传图谱构建3.3.1A01染色体多态性引物的筛选验证与图谱构建在A01染色体上通过对134对SSR标记和40对SNP标记进行筛选，共15对SSR标记和6对SNP标记在亲本之间有多态性，经群体筛选验证后，有5对SSR标记与抗病表型连锁，即C228、C230、ACMP473、C234、ACMP334和C141，这些标记长短均在100～200bp之间，在丙烯酰胺凝胶电泳下均有很好的区分，附表3-3为这些引物的信息。利用JoinMap4.0与Mapchart软件对A01染色体上的实验数据进行统计分析，发现C230与ACMP473与A01染色体上的抗病基因较近，遗传距离分别为1.5cM和3.4cM，两标记之间的物理距离为0.44Mb。
【参考文献】

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本文编号：2863961