拮抗轮枝镰刀菌的放线菌筛选及其活性代谢产物的初步研究

发布时间：2020-11-06 05:26

　　 植物病害是农业生产中一直存在的重大问题,它可以直接导致全球粮食作物和其余的农产品减产近20%。植物病原真菌是很常见的病原菌,很容易侵染植物,造成农作物的低产,因此对植物病害的防治是农业可持续发展道路的重要环节。轮枝镰刀菌作为水稻立枯病、玉米穗腐病、茄子枯萎病、番茄枯萎病等枯萎真菌病害的致病菌,严重制约了农作物的高产优质。目前,对于植物病害的防治措施主要以使用化学农药为主,但是化学农药给环境和人类带来了一定的安全隐患,农药残留、污染环境、打破生态平衡、使病原菌抗药性增强等问题逐渐凸显。生物防治因其与环境友好,与非靶标菌友好等特点引起了人们的关注,并且成为了新型农药研究的主要方向。放线菌作为微生物中产活性物质最高的一类菌群,其活性代谢产物被广泛地应用于农业和医疗领域,具有很大的发掘价值。本研究利用前期从河西走廊疏勒河流域盐碱土壤中分离筛选出的10株拮抗放线菌,筛选对轮枝镰刀菌等多种植物病原真菌有拮抗作用的放线菌,优化菌株发酵条件,探索其稳定性,并且从放线菌的发酵产物中分离纯化出有效活性代谢产物,对其进行活性及抑菌机理研究,以期为下一步生物农药的开发等研究提供基础,具体结果如下:1.利用常见的6种放线菌生长培养基对实验室前期已有的10株放线菌进行最优培养基的选择,确定A12211在高氏一号培养基上产孢情况最好;4-3-5,221,B2-304在Isp_2培养基上产孢情况最好;4-2-1在Isp_3培养基上产孢情况最好;B2-202在Isp_4培养基上产孢情况最好;DA4-3-12,DA8-4-10,DA8-3-15,16-3-10在Ms培养基上产孢情况最好。2.采用琼脂扩散法,以常见的六种植物病原菌为靶标菌,对长势较好的7株放线菌进行初筛,菌株DA4-3-12对六种植物病原真菌均具有抑制作用,且对轮枝镰刀菌的抑制效果最好;以轮枝镰刀菌为靶标菌,利用琼脂扩散法对7株放线菌在不同发酵时间下的抑菌活性进行复筛,结果表明,菌株DA4-3-12产抑菌活性物质的能力最强且最稳定,所以确定菌株DA4-3-12为后续的目标菌株。3.采用单因素和正交试验对菌株DA4-3-12进行液体发酵条件优化,结果表明,菌株DA4-3-12最优发酵条件:接种量7%,发酵时间156 h,起始pH11,装液量90/250 mL。优化后菌株DA4-3-12的抑菌圈直径达到了3.40 cm。4.采用琼脂扩散法测定不同条件对菌株DA4-3-12发酵上清液抑菌活性稳定性的影响,结果表明,不同温度、贮存时间、紫外照射时间、酸碱条件、蛋白酶条件下发酵液上清的抑菌活性均具有稳定性,对金属离子不稳定,在后期试验、保存、运输过程中应该注意避免接触含铁、铜、锌、铝的各种容器,以免影响发酵液抑菌活性。5.对菌株DA4-3-12发酵上清液活性成分理化性质研究结果表明,该抑菌活性物质可以溶于氯仿等有机溶剂;利用草酸沉淀和丙酮沉淀法处理发酵液后沉淀均无抑菌活性,证明该抑菌活性物质为非蛋白类物质;菌株DA4-3-12发酵液经过大孔吸附树脂处理后,不仅可以对发酵液中的抑菌活性物质进行分离,还可以增强发酵液抑菌活性。6.以活性跟踪法为指导思想,采用琼脂扩散法,利用离心、大孔吸附树脂、硅胶柱层析等分离方法对菌株DA4-3-12的发酵活性物质进行分离除杂后,用制备型高效色谱仪对样品进行纯化,获得了一种抑菌活性物质A1,分子量为1354.8,推测化合物的化学式为C_(62)H_(117)N_9O_(23),结合质谱分析及文献调研,初步确定该物质为新型活性物质。7.采用显微观察等方法研究菌株DA4-3-12发酵液活性提取物的抑菌机理发现,用菌株DA4-3-12发酵液粗提物处理病原菌轮枝镰刀菌120 h后,病原菌菌丝的生长、孢子的产生均受到抑制,孢子停止萌发;发酵液活性物质粗提物对病原菌的菌丝及孢子的形态均有影响,经处理后,菌丝有断裂、膨胀、畸形等变化,孢子形态呈不规则的线状、隔断消失,表面有疱疹状突起;同时病原菌细胞膜通透性也发生了变化,说明该活性物质对病原菌的细胞膜产生了损害。
【学位单位】：西北师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：S476
【部分图文】：

第4章拮抗菌株DA4-3-12抑菌活性产物的分离纯化35图4-1菌株DA4-3-12发酵液去蛋白处理后的生测图Fig.4-1BioassayofdeproteinizedfermentationbrothofstrainDA4-3-12A:发酵滤液B:调酸后上清液C:加丙酮后上清液D:丙酮E:调酸后沉淀F:加丙酮后沉淀A:Fermentationbroth;B:Addacidandsupernatant;C:Supernatantwithacetone;D:Acetone;E:Aftertheacidprecipitation;F:Acetoneisaddedtoprecipitate;如表4-4和图4-1所示，菌株DA4-3-12发酵液经过草酸调酸和丙酮处理后的上清液都具有生物活性，调酸和丙酮处理后的沉淀均没有生物活性。结果表明发酵液在经过调酸和丙酮处理两个过程可以除去大量杂蛋白，活性物质损失少，表明该活性物质是非蛋白，这为活性物质的进一步纯化提供了基矗4.3.2大孔吸附树脂HP-20对发酵产物的分离及影响菌株DA4-3-12的液体发酵经过添加大孔吸附树脂HP-20处理后（图4-2），结果表明，发酵上清液无抑菌活性，大孔吸附树脂经甲醇洗脱后的旋蒸提取物有抑菌活性，说明大孔吸附树脂对抑菌活性物质有吸附作用，可以通过在发酵液中添加大孔吸附树脂对抑菌活性物质进行分离。另外，经过大孔吸附树脂处理后的抑菌活性较不含有大孔吸附树脂的发酵液的抑菌活性有明显增强，可能是因为添加大孔吸附树脂后避免了产物抑制，从而提高发酵产物的产量。大孔吸附树脂的添加量对抑菌活性也有明显的影响，如图4-3所示，随着大孔吸附树脂添加量的增加，呈现出先增长后下降的趋势，当大孔吸附树脂的添加量为7%时，抑菌圈直径最大，抑菌活性最强。如表4-5所示，在对发酵液中的大孔吸附树脂用不同浓度甲ABCDEFABCDEF

第4章拮抗菌株DA4-3-12抑菌活性产物的分离纯化36醇洗脱剂进行洗脱后，只有经过浓度为100%的甲醇洗脱剂洗脱后的有机相浓缩物有抑菌活性，其余浓度的甲醇洗脱剂均未表现出抑菌活性，后期的分离过程中可采用分析纯甲醇对活性物质进行洗脱。图4-2大孔吸附树脂对菌株DA4-3-12发酵液抑菌活性物质的分离、增强效果Fig.4-2EffectofadsorptionresinonisolationandEnhanceofbacteriostaticactivesubstancesinthefermentationbrothofstrainDA4-3-12A：添加树脂后的发酵滤液；B：树脂的甲醇洗脱物；C：未添加树脂的发酵滤液；A:fermentationfiltrateafteraddingresin;B:methanoleluentoftheresinC:fermentationfiltratewithoutaddingresin;035792.52.62.72.82.93.0bcbab抑菌圈直径Diameterofbacteriostaticzone/cm树脂添加量Resincontent/g图4-3大孔吸附树脂添加量对菌株DA4-3-12发酵液抑菌活性的影响Fig.4-3EffectoftheadditionofmacroporousadsorbentresinontheantibacterialactivityofthefermentationbrothofstrainDA4-3-12ABCB

第4章拮抗菌株DA4-3-12抑菌活性产物的分离纯化38图4-5DA4-3-12发酵液氯仿萃取后的结果Fig.4-5ResultsofchloroformextractionfromDA4-3-12fermentationbrothA：氯仿处理；B：有机相；C：发酵液；D：水相A:Chloroformtreatment;B:Organicphase;C:Fermentationbroth;D:Aqueousphas4.3.4硅胶柱层析分离结果用不同极性的洗脱剂对样品洗脱后，表现出了不同的抑菌效果（表4-6），结果显示，石油醚为洗脱剂时，1-8瓶的平均抑菌圈直径为1.3cm，9-10瓶无抑菌效果；洗脱剂为二氯甲烷时，第7瓶的抑菌圈直径为1.2cm；当洗脱剂为二氯甲烷：乙酸乙酯=1:1时，抑菌圈直径为1.0cm；当乙酸乙酯为洗脱剂时，1-4瓶的平均抑菌圈直径为1.5cm，5-8瓶的平均抑菌圈直径为1.0cm，第9瓶时，抑菌圈直径为1.7cm；当洗脱剂为丙酮时，第8瓶表现出抑菌活性为3.1cm；当洗脱剂为甲醇时，从第1瓶到第8瓶都表现出了很好的抑菌活性，其中第2瓶时抑菌活性最强达到4.7cm，总体上呈现出了先增大后减小的趋势,其余的洗脱产物都没有抑菌活性；最后确定该抑菌活性物质可被不同洗脱剂洗脱下来，但是甲醇洗脱下来的F2为主要的活性组分，最终收集甲醇洗脱后的第二瓶样品，旋蒸后保存备用，命名为WN001。ACDB
【参考文献】

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本文编号：2872711