农杆菌介导的核桃体细胞胚转基因研究

发布时间：2020-11-10 10:22

　　 随着现代分子生物学的发展,植物转基因技术在基因功能研究和转基因新品种培育方面具有非常重要的意义。农杆菌介导法已广泛用于植物的遗传转化,改善植物对生物和非生物胁迫的耐受能力,改善养分捕获和抗虫抗病能力,提高作物生产力并减少有害农药的使用。本研究以核桃幼胚为外植体,对从幼胚诱导体胚以及体胚成熟与萌发的条件进行了优化;采用农杆菌介导法,将JrWRKY4基因转入核桃体胚。研究核桃体细胞胚转基因体系构建的优化条件,为核桃基因功能分析和转基因育种奠定了基础。主要结果如下:1.本实验以核桃幼胚子叶为外植体,诱导体胚分化、成熟,并获得再生植株。通过体胚形成和发育过程的形态学和细胞学观察,揭示了核桃体胚发育的球形期、心形期、鱼雷形期、子叶期等过程的结构变化,明显观察到体胚的极性发育过程,与合子胚形成过程相似。观察到球形期中内层细胞分裂成基础的维管组织,鱼雷型期中原形成层已发育,清晰地看到极性的逐步建立,子叶形期中清楚的观察到Y型维管束等过程。2.农杆菌介导的核桃体细胞胚转基因体系构建:选取长势良好的未转化的核桃体细胞胚,为了能达到筛选效果,遗传转化的抗生素选择压为50mg·L~(-1)的卡那霉素;通过优化体胚转基因条件,农杆菌菌液浓度OD_(600)=0.6,侵染时间为20min,共培养1 d,抑菌剂羧苄青霉素浓度为250 mg·L~(-1),将PRI101-JrWRKY4转入核桃体胚。3.经过卡那抗性筛选的体胚,用PCR检测能扩增出约1554bp的条带;对转基因体胚中JrWRKY4基因的表达量进行qRT-PCR检测,JrWRKY4基因在核桃转基因体胚中的表达量与未转化的体胚相比明显上升,转基因体胚中JrWRKY4基因的表达量是未转化体胚表达量的近10倍;对已转化的体胚进行Western Blot检测,可检测到约90KD的目的条带。
【学位单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：S664.1
【部分图文】：

，2011）。李迎超（2010）以“绿岭”核桃为试材，通过显微观察、运用石蜡切片和组织培养技术，观察了“绿岭”核桃的开花物候期和雌花开放过程，调查了雌花套袋、切柱头和聚乙烯醇封柱头3种处理方法的核桃无融合生殖坐果情况，并对无融合生殖过程中胚珠、胚囊和胚胎的发育以及果实性状、胚的倍性进行了研究。张启香以自然授粉后的山核桃幼胚为外植体再生出完整植株，并且对其发育过程进行了组织细胞学观察（张启香，2011）。尽管体细胞胚发生已经在许多木本物种中广泛使用，但繁殖成年木本植物仍然很困难（GuanY，2016）。图1.1山核桃体胚发生期的组织细胞学观察（张启香，2011）Fig1.1histocytologicalobservationofsomaticembryogenesisofpecan(qixiangzhang,2011)

合∈?000倍，适量，加至上膜中，4℃孵育8h；3）一抗稀释液倒回原处（可低温下保存），PBST的缓冲液冲洗该膜5次，每次4min左右。4）抗体稀释液稀释二抗2000倍使用，4℃，孵育3-4h。5）二抗稀释液倒至原处，4）中缓冲液洗此膜6次，每次4min。6）显影：显影液加至PVDF膜，使用BIO-RAD蛋白成像仪显影，拍照且保存图片。3结果与分析3.1核桃体胚形态学及组织细胞学观察1.以核桃优株B26幼胚的子叶为外植体，取长度约5mm，通过再生诱导培养基DKW+1mg·L-16-BA+0.1mg·L-1IBA+2mg·L-1KT，诱导分化出核桃初代体细胞胚（如图3.1-2）；选取长势良好的初代体细胞胚在增殖扩繁培养基上进行增殖，实验所用的培养基为DKW+30g蔗糖+7g琼脂，每个培养基接种4~8个初代体细胞胚，接种后每周转移一次至新鲜培养基。暗培养，培养温度为22±1℃，7-14d得到次生胚及胚性愈伤（如图3.1-3和图3.1-4）；选取长势良好的次生胚，接种到生根诱导培养基DKW+15g蔗糖+7g琼脂+2mg·L-1GA3，光照培养14-30d诱导生根（如图3.2）。观察到从体细胞胚发育成完整植株的过程。（图3.1和3.2）。图3.1体细胞胚的诱导分化Fig.3.1differentiationofsomaticembryos注：1为核桃子叶；2为子叶分化出初生体细胞胚；3、4为初生体细胞胚的增殖分化Note:1iswalnutcotyledon;2.Cotyledonsdifferentiateintoprimarysomaticembryos;3and4aretheproliferationanddifferentiationofprimarysomaticembryos

山东农业大学硕士专业学位论文21图3.2体细胞胚各发育期Fig3.2developmentstagesofsomaticembryos2.核桃次生胚是通过表皮单细胞起源方式产生的，通过体细胞胚的解剖学处理，对其进行了组织细胞学观察，观察到体胚的球形期、心形期、鱼雷形期、子叶期（图3.3），明显观察到核桃体胚为极性发育。图3.3-1为球形期，内层细胞分裂成基础的维管组织；图3.3-3为鱼雷型期，其中原形成层已发育，能够清晰地看到极性的逐步建立；图3.3-4为子叶形期，已经能够清楚的观察到Y型维管束。图3.3体细胞胚切片观察注：1.球形期晚期；2.早期心形期；3.鱼雷形期；4.子叶形期Fig3.3observationofsomaticembryoslicesNote:1.Latesphericity;2.2.Earlyheart-shapedperiod;3.Torpedoshapedperiod;Cotyledonstage3.2体胚抗生素选择压的确定如图3.4所示，Kan会抑制未转化体胚的增殖，随着Kan浓度的增加，体胚增殖率不断下降。将生长良好的未转化体胚接种到含不同浓度Kan的培养基上，14d后观察到各培养基上体胚生长状况不同。在Kan浓度为0mg·L-1的培养基中，体胚的增殖率为90％；当Kan浓度为25mg·L-1时，体胚增殖率68%；当Kan浓度为50mg·L-1时，有褐化现象出现（如图3.5），生成少数次生胚，体胚的增殖率为38%（图3.4）；当Kan浓度大于或等于75mg·L-1时，体胚不能正常增殖，体胚大小无变化，最终多褐化死亡。为
【参考文献】

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本文编号：2877823