基于转录组测序对菊花耐盐性的研究

发布时间：2020-11-12 11:53

　　 盐胁迫严重影响菊花的生长与生产,因此挖掘响应盐胁迫关键基因显得尤为重要。本研究试验材料选用菊花‘神马’(Chrysanthemum moliflium‘Jinba’),选定合适的处理时间和浓度后,对正常培养和盐胁迫下的菊花根系进行转录组测序,筛选重要通路及相关差异表达基因,利用qRT-PCR验证候选基因的表达,同时,测定盐胁迫前后菊花根系的离子含量,渗透调节物质含量,抗氧化酶活性等生理指标的变化。主要研究结论如下:1、分别用100、200、300 mM NaCl处理0、3、6、12、24、36、48 h后,测定菊花叶片电导率、丙二醛含量、叶绿素含量和根系活力的变化。结果表明,在100 mM盐处理下,各项指标的变化与对照组相差不大;在300 mM盐处理下,各项指标均表现显著上升或下降的趋势;而在200 mM盐处理下,尤其处理24 h变化显著,我们推测菊花利用体内的调节机制适应胁迫环境,由此确定了24 h和200 mM为转录组测序的合适值。2、利用Illumina Hiseq测序平台对菊花根系进行转录组测序,创建了6个cDNA文库(CK1、CK2、CK3、SS1、SS2、SS3)。共获得大约68.30 Gb有效序列,经从头组装得到70,764个unigenes,并与公共数据库TrEMBL、NR、Pfam、KOG、GO和KEGG比对得到基因注释,几乎涵盖了所有的功能和代谢通路。以|log2(fold change)|1且P值≤0.05为筛选标准,鉴定出2117个差异表达基因,包括1347个上调基因和770个下调基因,有大量差异表达基因富集到调控细胞内各种生理生化过程中,为研究菊花根系的耐盐调控机制提供了丰富的数据。3、根据基因功能注释、富集结果以及前人研究,筛选了与信号转导、植物激素、离子转运、渗透调节、抗氧化调节、重要功能蛋白相关的差异表达基因,以及转录因子,并从中选取20个差异倍数较大的基因作为候选基因,利用qRT-PCR测定其在盐胁迫后0、3、6、12、24、36、48 h的表达模式。不同DEGs的表达模式有差异,暗示这些基因可能通过不同的调控途径参与菊花根系胁迫响应,也验证了测序结果的可靠性。4、离子含量测定表明:Ca~(2+)含量呈现先升高后下降的趋势;胁迫初期Na~+外流含量降低,K~+内流显著增大,含量升高,而随着胁迫时间的增长两者又受到抑制。5、渗透调节物质含量测定表明:盐胁迫下菊花根系各渗透调节物质积累进程不同,脯氨酸含量呈现先升高后下降的趋势,可溶性糖含量始终处于增加状态,积累较多。6、抗氧化物酶活性测定表明:POD活性呈现先升高后下降的趋势;SOD活性始终受到抑制;CAT活性在初期受到抑制,而后又被激活。综上所述,本研究基于转录组测序筛选菊花根系响应盐胁迫的耐盐基因,并鉴定候选基因,比较其表达模式差异,将基因表达与生理数据结合起来,阐述菊花耐盐机理。
【学位单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：S682.11
【部分图文】：

菊花耐盐性检测（A）REC测定；（B）MDA含量测定；（C）叶绿素含量测定；（D）根系活力测定Fig.3-1Salttolerancetestofchrysanthemum(A)DeterminationofREC;(B)DeterminationofMDA;(C)Determinationofchlorophyllcontent;(D)Determinationof

基于转录组测序对菊花耐盐性的研究163.2.2组装结果统计分析本研究共组装得到95,476条transcripts和70,764条unigenes，其中unigenes的长度从200bp到1000+bp不等。大多数unigenes在200和500bp（59.32%）之间，长度超过1000bp的unigenes占10.80%。Transcript的N50为845，unigene的N50为853，组装完整性较高，具体组装结果如表3-1、图3-2所示。表3-2从头测序组装统计Table3-2denovotranscriptomeassemblystatisticsAll(>=200bp)>=500bp>=1000bpN50GC(%)TotalLengthMaxLengthMinLengthAverageLengthTranscript95476499471751784543.256886571016890300721Unigene70764356331288585343.385093924516890300719注：N50:将transcript从长到短排序，依次累加transcript碱基数，当累计碱基数达到transcript总碱基数50%时的transcript的长度，unigene采用相同的方法。Note:N50:Rankthetranscriptfromlongtoshort,andthenaccumulatethenumberoftranscriptbases.Whenthecumulativenumberofbasesreaches50%ofthetotalnumberofbasesinthetranscript,unigeneadoptsthesamemethod.图3-2unigenes长度分布和unigenes、transcript长度分布比对Fig.3-2Unigeneslengthdistributionandunigenes、transcriptlengthdistribution

山东农业大学硕士学位论文173.2.3Unigene功能注释结果分析本研究将70,764个unigenes分别与公共数据库TrEMBL、NR、Pfam、KOG、GO和KEGG比对，注释统计结果见表3-3，比对到各数据库的unigene数量分别占基因总数的58.30%、50.50%、43.00%、44.50%、42.80%、11.50%。表3-3Unigene功能注释成功率统计Table3-3UnigenefunctionannotationsuccessratestatisticsValuesTotalTrEMBLNRPfamKOGGOKONumber7076441249357263041231510302578164100%58.30%50.50%11.50%Percentage43.00%44.50%42.80%3.2.3.1NR注释结果分析NR库属于非冗余蛋白序列数据库，比对到NR库中unigene数目比例大于1%的物种的分布如图3-3所示，占总量的比值最大的是拟南芥（Arabidopsisthaliana）为49.6%，其次是水稻（Oryzasativa）占20.9%，集胞藻（Synechocystissp）占1.6%，此外，其他以及未知物种比例为8.6%、2.9%。图3-3NR库注释物种分布图Fig.3-3AnnotatedspeciesdistributionmapofNR3.2.3.2KOG注释结果分析本研究中有31,510个unigenes被注释到KOG数据库并进行功能分类，这些unigenes覆盖25个功能类别，其中“基因功能未知”（generalfunctionpredictiononly）基因数量最多，其次是“翻译、核糖体结构和生物发生”（translation，ribosomalstructureandbiogenesis），“翻译后修饰、蛋白质周转、伴侣蛋白”（posttranslationalmodification，proteinturnover，chaperones）和“信号转导机制”（signaltransductionmechanisms），具体情况如图3-4所示。结果表明，测序组装获得的unigene几乎覆盖了基因的全部功
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本文编号：2880715