大豆慢生型根瘤菌Bradyrhizobium diazoefficiens群体感应系统在共生过程中的功能研究

发布时间：2020-11-17 19:42

　　 细菌的群体感应系统(Quorum sensing,QS)是依赖于种群密度的细菌之间的信息交流。群体感应系统能够调节自由生活细菌的群体行为,也可调控与宿主之间的相互作用。大豆慢生型根瘤菌Bradyrhizobium diazoefficiens USDA110能与大豆形成根瘤,具有优良的共生固氮特性。对该根瘤菌群体感应系统进行研究,有助于加深对大豆-根瘤菌共生固氮体系的认识,为根瘤菌的农业生产应用提供理论依据,也对全球氮生态循环研究具有重要的意义。本论文以大豆慢生型根瘤菌模式菌株Bradyrhizobium diazoefficiens USDA110(B.d 110)为研究对象,探究了染色体上LuxI-LuxR型群体感应基因blr1062(bjaR1)-blr1063(bjaI)在根瘤菌共生中的生物学作用。研究结果如下:1.blr1062调节基因与blr1063结构基因作为一个操纵子发挥功能,相互之间进行环式调控;blr1063基因的表达受到大豆金雀异黄酮(Genistein)诱导,但是被大豆种子浸提液(SSE)显著抑制。与野生株相比,blr1062突变株在半固体丰富培养基(YMB)上运动性显著增强48.3%,表明blr1062突变有利于根瘤菌快速在大豆植株根部定殖,以形成根瘤。2.与大豆的接种实验结果显示:与野生株相比,blr1062突变株接种的大豆在侧根上的根瘤数增加,总根瘤数与根瘤干重略有提高,固氮酶活性及根系表面积分别显著增加82.6%和9.9%,表明blr1062的突变有利于结瘤固氮。这也进一步表明,Blr1062可能是作为负调控因子参与这些共生固氮过程。3.在综合文献的基础上,构建了B.d 110中参与结瘤调控关键基因的lacZ报告基因转录融合体。相较于野生株,blr1062突变株中参与负调控结瘤数的nwsA、nolA与nodD2调控基因,特别是后两者的表达显著降低,而参与结瘤因子合成的结构基因nodY的表达显著增强;与此相反,正调控结瘤数的nodD1、nodW等基因的表达差异不明显。此外,blr1062的突变降低了三型分泌系统中相关基因(ttsI与rhcN)的表达,但是差异不明显。这些结果表明,群体感应系统可能通过NolA以及NodD2参与负调控根瘤菌结瘤过程,这也与接种实验结果相一致。4.转录组分析结果显示,上述参与结瘤调控关键基因的表达与通过lacZ报告基因获得的结果基本相一致。此外,blr1062的缺失突变使得KEGG富集中大量参与氮代谢通路上相关基因的表达显著下调。在添加不同氮源的最小液体培养基中,blr1062突变体菌株与野生体菌株生长呈现明显差异,表明群体感应系统可能参与根瘤菌的氮代谢过程,从而影响固氮酶活性,但是机理不清楚。蛋白质组学分析显示,尽管差异蛋白的结果与转录组获得的差异基因的结果并不相关,但是KEGG通路富集中,参与群体感应系统的大量基因在翻译水平显著上调。此外,氮代谢过程中,只有谷氨酰胺合成酶与谷氨酸脱氢酶的蛋白表达显著下调,并得到酶活性分析的验证支持。综合以上结果,大豆慢生型根瘤菌中的群体感应系统可能通过NodD2参与根瘤菌负调控结瘤,并且参与氮代谢过程,从而影响根瘤菌的固氮作用。
【学位单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：S565.1
【部分图文】：

兰州大学硕士学位论文大豆慢生型根瘤菌Bradyrhizobiumdiazoefficiens群体感应系统在共生过程中的功能研究2于植物根系，根毛弯曲，随后根瘤菌侵入根毛。根瘤菌进入植物体后，经历一个分化过程，开始表达固氮酶以及其它固氮所必需的基因，从而给植物提供氮源[5]。根瘤菌与大豆发生共生结瘤一般包含以下几个过程：（1）根瘤菌感知到豆科植物根系分泌到根际的信号分子例如类黄酮化合物（图1.1a），诱导细菌调节蛋白NodD激活参与菌株特异性信号分子合成的nod（结瘤）基因转录（也被称为Nod因子/NFs）；（2）根瘤菌附着在根毛的顶端，分泌NFs，开启根瘤发育过程，包括根毛变形和皮层内根瘤原基的形成（图1.1b）；（3）根毛顶端的根瘤菌进入卷曲的根毛中形成感染线，之后在根毛内部伸长，穿过多个细胞层，到达正在发育的根瘤原基[6]（图1.1c-f）；（4）根瘤菌通过一种类似内吞作用的机制侵入植物细胞质，细胞扩大，形成称为共生体的细胞器样结构（图1.1g）开始固氮[7]；（5）根瘤菌DNA在入侵的植物细胞中复制，而被感染的植物细胞则成为拥有数千个共生体的大型多倍体细胞[8]；（6）有限根瘤无持续的分生组织，变成球状（图1.1h-j），成熟的共生体包含多个正常大小的类菌体；（7）根瘤开始从中心衰老，并延伸到周围[9]，从解体的根瘤菌释放进入下一个生命周期（图1.1k）。图1.1有限根瘤形成过程[10]Fig1.1Theprocessoflimitednoduleformation大豆植物与根瘤菌的共生固氮体系具有很高的经济与生态效益，共生系统的建立涉及双方信号物质的交流。对共生固氮过程中根瘤菌与大豆如何进行信号传递，以促进双方的生长与发展的研究具有重大意义，同时也为进一步促进绿色农业和生态文明建设提供科学依据。1.2群体感应系统介绍1.2.1细菌的群体感应系统细菌在

兰州大学硕士学位论文大豆慢生型根瘤菌Bradyrhizobiumdiazoefficiens群体感应系统在共生过程中的功能研究6图1.2群体感应系统中有关的信号通路[44]Fig1.2Relatedsignalpathwaysinquorumsensingsystem2011年在B.d110中发现了一处参与群体感应信号分子合成的基因位点：bjaI，它的多肽序列与两种AHL合成酶（BtaI和RpaI）密切相关，并产生了一种独特的高丝氨酸内酯（HSL），此信号分子不是BtaI和RpaI产生的芳基-HSL，而是支链脂肪酰基-HSL，即异戊酰基高丝氨酸内酯（IV-HSL）。参与信号分子合成与调控基因位点是bjaR1和bjaI（图1.3）。其中结构基因bjaI（blr1063）是LuxI家族同源物，编码产生的IV-HSL合成酶不像其他脂肪酰基-HSL合酶选择酰基-ACP作为活化的脂肪酸底物，而是利用酰基-CoA作为酰基载体，催化合成IV-HSL。因此AHL合成酶亚家族，包括RpaI，BtaI和BjaI[45]。调节基因bjaR1（blr1062）是LuxR家族同源物，可与低密度的IV-HSL结合，激活下游基因表达。细菌通常需要纳摩级信号浓度[46]来激活下游基因，但B.d110产生的IV-HSL大约是2-10nM，而IV-HSL浓度为10pm就可诱导bjaR1基因的表达，表明IV-HSL的产生量能够建立一个群体感应信号通路[45]，虽然诱导bjaI表达的基础水平低，但通过外源添加IV-HSL可使bjaI基因表达增强约20倍，并且B.d110不需要外源底物来产生IV-HSL。CarolineS.Harwood等人虽然分离纯化了自诱导物IV-HSL，并首次阐明了该位点作为LuxR/LuxI型群体感应效应系统的一些独特性，但是B.d110是共生固氮细菌，此群体感应的两个基因位点bjaR1（blr1062）-bjaI（blr1063）是否以及如何参与共生没有研究。因此本文对此位点的基因功能进行了探究。

兰州大学硕士学位论文大豆慢生型根瘤菌Bradyrhizobiumdiazoefficiens群体感应系统在共生过程中的功能研究7图1.3bjaR1-bjaI基因位点[45]Fig1.3ThegenelocusofbjaR1-bjaI1.3实验内容和目的、意义1.3.1实验内容和目的本研究主要内容包括：（1）群体感应系统表达模式分析，blr1062缺失突变对大豆植株的共生固氮影响；（2）利用lacZ报告基因，比较探究blr1062突变株与野生株中，调控结瘤基因表达信号通路上关键基因的表达模式；（3）利用转录组与蛋白组学手段，从全基因组水平，分析blr1062突变带来的调控网络变化。研究目的：围绕参与群体感应的两个基因（blr1062与blr1063），在构建缺失突变株基础上，构建功能回复株及相关的lacZ融合菌株，探究此基因位点是否影响共生，阐明此位点缺失对于和结瘤基因有关的信号通路的影响，同时运用转录组与蛋白组学初步挖掘影响共生的机制。1.3.2研究意义多个国家在农业生产上面临为提高产量长期使用化学施肥，造成土壤结块、耕地质量下降、生态系统遭到破坏等一系列问题。为了农业可持续发展以及大自然与人的和谐相处[47]，具有高效固氮能力的根瘤菌可应用于生产，不仅可以增强大豆结瘤固氮能力，而且能减少使用氮肥带来的生态环境污染问题。为更好地提高农作物产量与质量，减少对生态环境造成的伤害，许多国家包括中国正致力于研发高质量菌株，促进绿色农业的发展。在根瘤菌中，B.d110由于能与大豆形成根瘤且具有优良的共生固氮特性成为最重要的农业物种，被广泛应用于分子遗传学和生态学。影响根瘤菌和宿主植物相互作用的一个重要因素是群体感应系统，长期以来，对于群体感应基因的功
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本文编号：2887846