G蛋白偶联受体T1R1/T1R3介导mTOR信号通路对小鼠乳蛋白合成的调控机制研究

发布时间：2021-01-04 10:54

　　乳蛋白因其具有较高的营养价值和在农业生产中的重要性而受到关注。因此,提高奶用动物乳蛋白的产量,改善乳蛋白的组成一直是动物营养学家所关注的热点,阐明乳蛋白合成调控的机制是目前解决上述问题的关键所在。本研究中通过使用T1R1 siRNA干涉小鼠乳腺上皮细胞系（HC11）中的T1R1并结合氨基酸（AA）刺激,发现T1R1参与小鼠乳腺上皮细胞AA的感知;抑制T1R1后HC11细胞mTOR信号通路的活性被显著抑制。必需氨基酸转运进入细胞受氨基酸转运蛋白的识别和转运,研究同时发现抑制T1R1使氨基酸转运蛋白SLC7A5、SLC3A2和SLC1A5的表达量显著上调;但细胞内AA的浓度差异不显著,结果也进一步的证实了敲低T1R1会使氨基酸转运蛋白表达上调而不影响细胞内AA的浓度的已有结论。通过使用氨基酸转运蛋白抑制剂2-氨基双环-（2,2,1）-庚烷-2-羧酸（BCH）和γ-L-谷氨酰对硝基苯胺-水合物（GPNA）,证实氨基酸转运蛋白也参与mTOR信号通路的调控,T1R1 siRNA与BCH、GPNA联合作用可以进一步抑制mTOR信号通路的活性。以T1R1基因敲除小鼠为模型,发现敲除T1R1可以显著下... 

【文章来源】：江苏师范大学江苏省

【文章页数】：86 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
1 引言
2 文献综述
    2.1 乳腺泌乳研究进展
        2.1.1 泌乳及其调节
        2.1.2 乳蛋白的组成及功能
        2.1.3 乳蛋白合成及调控
    2.2 mTOR信号通路研究进展
        2.2.1 mTOR信号通路概述
        2.2.2 mTOR上游信号通路
        2.2.3 mTOR下游信号通路
    2.3 氨基酸与mTOR信号通路的调控
    2.4 G蛋白偶联受体T1R1/T1R3及对mTOR信号通路的调控
        2.4.1 G蛋白偶联受体
        2.4.2 T1R1/T1R3与氨基酸的感知及mTOR信号通路的调控
3 T1R1/T1R3对小鼠乳腺上皮细胞系HC11细胞氨基酸的感知和乳蛋白的合成调控机制研究
    3.1 实验材料
        3.1.1 实验样品
        3.1.2 细胞培养及处理
        3.1.3 实验所用试剂
    3.2 实验方法
        3.2.1 RNA干涉
        3.2.2 不同抑制处理
        3.2.3 细胞总RNA提取及反转录
        3.2.4 实时荧光定量PCR（qPCR）
        3.2.5 Western blot
        3.2.6 氨基酸浓度分析
        3.2.7 数据分析
    3.3 结果分析
        3.3.1 T1R1与T1R3在HC11细胞中的表达情况分析
        3.3.2 干涉T1R1对 β-casein的影响分析
        3.3.3 沉默T1R1对mTOR的影响
        3.3.4 抑制T1R1对氨基酸转运蛋白的影响
        3.3.5 沉默T1R1和抑制氨基酸转运蛋白对mTOR信号通路的作用
        3.3.6 沉默T1R1对HC11细胞内氨基酸浓度的影响
    3.4 讨论
    3.5 小结
4 T1R1/T1R3对小鼠乳腺组织不同时期乳蛋白合成的调控机制研究
    4.1 实验材料
        4.1.1 实验动物
        4.1.2 实验设计
        4.1.3 实验试剂
        4.1.4 实验仪器
    4.2 实验方法
        4.2.1 小鼠基因分型
        4.2.2 实验小鼠样品采集
        4.2.3 冰冻切片及免疫荧光（Immunofluorescence）
        4.2.4 泌乳量测定
        4.2.5 RNA提取及反转录
        4.2.6 实时荧光定量PCR
        4.2.7 Western blot
        4.2.8 数据处理
    4.3 结果分析
        4.3.1 鼠尾DNA质量检测
        4.3.2 小鼠基因分型
        4.3.3 小鼠乳腺组织中T1R1与T1R3的表达情况分析结果
        4.3.4 qPCR及Western blot分析T1R1在小鼠乳腺上皮细胞中的表达情况
        4.3.5 T1R1敲除小鼠与野生型小鼠泌乳量测定结果
        4.3.6 β-酪蛋白合成检测
        4.3.7 敲除T1R1对mTOR信号通路的影响分析结果
        4.3.8 敲除T1R1对氨基酸转运蛋白的影响分析结果
    4.4 讨论
    4.5 小结
5 T1R3对T1R1 KO及WT小鼠mTOR信号通路的调控分析
    5.1 实验材料
        5.1.1 实验动物
        5.1.2 实验试剂
    5.2 实验方法
        5.2.1 外植体的准备
        5.2.2 外植体的培养及处理
        5.2.3 Western blot
        5.2.4 数据处理
    5.3 结果分析
        5.3.1 T1R3在小鼠乳腺中的表达分析
        5.3.2 抑制T1R3对T1R1 KO及WT小鼠mTOR信号通路的影响
    5.4 讨论
    5.5 小结
6 结论与创新点
    6.1 结论
    6.2 创新点
    6.3 展望
附录
    附录1 主要实验仪器及试剂
        1.1 主要实验仪器
        1.2 试剂
        1.3 溶液的配制
    附录2 细胞及组织总RNA的提取
        2.1 总RNA提取步骤
        2.2 总RNA质量分析
        2.3 总RNA浓度测定
    附录3 Western blot实验
        3.1 Western blot相关试剂配制
        3.2 BCA定量
        3.3 Western blot实验步骤
    附录4 冰冻切片及免疫荧光
        4.1 冰冻切片
        4.2 免疫荧光（双标）
    附录5 pMD 19-T基因克隆转化实验
参考文献
致谢
作者简历
学位论文数据集


【参考文献】：
期刊论文
[1]牛奶乳脂肪和乳蛋白的合成与调控机理[J]. 王加启.  饲料与畜牧. 2011(02)

硕士论文
[1]鲁西牛消化道各段T1R1、T1R3及pepT1基因的表达差异性研究[D]. 陈晓慧.江苏师范大学 2013



本文编号：2956645