烟草抗马铃薯Y病毒miRNA的筛选及相关miRNA的功能分析

发布时间：2017-04-09 20:03

  本文关键词：烟草抗马铃薯Y病毒miRNA的筛选及相关miRNA的功能分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：烟草是我国重要的经济作物,马铃薯Y病毒(PVY)是烟草上的主要病害之一,近几年,PVY在我国烟草主要产区爆发成灾,并且存在逐年加重的趋势。目前生产上对于PVY的防治尚无有效的药剂,因此,培育抗PVY的烟草品种是防治该病害最为有效的办法。然而,了解病毒与烟草相互作用的分子机理是解决这一问题的关键。研究表明,microRNA(miRNA)在调节植物对病毒的抗性方面具有重要作用,本文在探究PVY侵染对植物内源miRNA表达的变化的基础上,探索是否可以通过调控内源niRNA基因的表达从而起到抗病毒作用,为烟草的病毒防治和抗病育种提供一个新的思路。本研究获得的主要研究结果如下：1.对PVY侵染烟草样品及健康对照进行了小RNA(smallRNA,sRNA)测序,通过分析PVY侵染后烟草内源miRNA表达谱的变化,表明PVY能够显著影响烟草内源81个miRNA表达发生变化,其中上调表达niRNA57个,下调表达21个,对表达差异的niRNA进行靶基因预测。2.选择表达显著上调的烟草nta-mR156g、nta-miR396b、nta-miR169a、nta-miR6149a,显著下调的nta-miR6019a以及表达差异不显著的nta-miR168a、nta-miR172c进行Northern印迹杂交验证,杂交结果与测序及差异分析结果基本一致。3.筛选出nta-miR396b作为本文的研究对象,构建了nta-miR396b基因超量表达的植物表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化,将nta-miR396b转入烟草栽培品种“K326”中,获得了转基因植株。将转基因植株自交至T2代,用于后期研究。4.对T2代转基因烟草以未转基因植株作为对照进行PVY的抗病性鉴定,结果表明,转基因烟草的发病延缓,症状较未转基因烟草明显减弱,证实烟草miR396b具有抗PVY侵染的功能。本研究从miRNA的角度寻找PVY的防治途径,证明了烟草内源miRNA具有抗PVY侵染的功能。表明植物能以调节内源miRNA表达的方式间接抵抗病毒的侵染这一相互关系的存在,为植物抗病毒研究提供了新的思路。
【关键词】：马铃薯Y病毒 microRNA(miRNA) 超量表达载体构建 转基因植株
【学位授予单位】：浙江农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S435.72
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 1 前言9-23
• 1.1 烟草病害介绍9
• 1.2 马铃薯Y病毒对烟草的危害9-10
• 1.3 马铃薯Y病毒的致病机理10-11
• 1.4 植物miRNA的研究进展11-20
• 1.4.1 miRNA的发现及特征11
• 1.4.2 植物miRNA的合成与作用方式11-13
• 1.4.3 MiRNA调控植物发育13-14
• 1.4.4 MiRNA途径介导的基因表达14-15
• 1.4.5 MiRNA在逆境中的响应机制15-16
• 1.4.6 MiRNA的研究方法16-20
• 1.5 MiRNA对植物病毒的响应20-21
• 1.6 研究的来源及目的意义21-23
• 1.6.1 研究课题的来源21
• 1.6.2 研究的目的意义21-23
• 2 筛选烟草抗PVY的miRNA23-33
• 2.1 材料与方法23-26
• 2.1.1 烟草总RNA的提取23-24
• 2.1.2 烟草sRNA序列分析24
• 2.1.3 烟草miRNA注释分析24
• 2.1.4 烟草miRNA深层分析24-25
• 2.1.5 差异表达的miRNA杂交验证25-26
• 2.2 结果与分析26-33
• 2.2.1 RNA质量电泳结果26-27
• 2.2.2 SRNA测序结果27
• 2.2.3 SRNA长度分析27-29
• 2.2.4 烟草sRNA注释分析29
• 2.2.5 烟草miRNA深层分析29-32
• 2.2.6 差异表达的miRNA杂交验证32-33
• 3 Nta-miR396b的抗马铃薯Y病毒功能分析33-46
• 3.1 材料与方法33-40
• 3.1.1 合成nta-miR396b的前体序列33
• 3.1.2 超量表达载体的构建33-34
• 3.1.3 Nta-miR396b表达载体转化大肠杆菌34-35
• 3.1.4 农杆菌介导的遗传转化35-37
• 3.1.5 烟草叶片基因组DNA提取37
• 3.1.6 基因组DNA进行PCR检测37
• 3.1.7 转基因烟草Southern杂交验证37-39
• 3.1.8 转基因烟草的抗病性鉴定39
• 3.1.9 病毒含量测定39-40
• 3.2 结果与分析40-46
• 3.2.0 合成nta-miR396b前体序列40
• 3.2.1 Nta-miR396b超量表达载体的构建40-41
• 3.2.2 Nta-miR396b超量表达载体的转化大肠杆菌41
• 3.2.3 农杆菌介导的遗传转化41-43
• 3.2.4 PCR检测43-44
• 3.2.5 Southern杂交验证44
• 3.2.6 转基因烟草抗病性鉴定44-45
• 3.2.7 病毒含量测定45-46
• 4 讨论46-47
• 参考文献47-56
• 附录56-112
• 个人简介112-113
• 致谢113

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