PRRSV NADC30-like Nsp2蛋白单克隆抗体的制备及间接ELISA方法的建立
发布时间：2021-01-12 00:46
猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种严重危害养猪业的传染病,主要引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍以及仔猪的呼吸系统疾病。2014年底,PRRSV NADC30-like毒株在我国大规模流行,其Nsp2区域与HP-PRRSV毒株的Nsp2区域缺失不同,存在多个氨基酸的不连续缺失。此次疫情给我国养猪业造成了巨大的经济损失。流行病学调查发现,2014年后我国HP-PRRSV的阳性率逐年下降,而NADC30-like毒株的阳性率逐年升高,我国PRRSV流行毒株逐渐由HP-PRRSV毒株向NADC30-like毒株转变。本研究本着以防控该病并进一步进行亚型的鉴别诊断为目的,以PRRSV NADC30-like QHD1毒株的Nsp2为研究对象,开展了针对Nsp2单克隆抗体制备的相关研究。主要研究内容包括:1.PRRSV Nsp2蛋白单克隆抗体的制备在本实验室已分离到的QHD1毒株的基础上,通过设计特异性引物扩增Nsp2基因,利用原核表达系统构建重组质粒pET-32a（+）-Nsp2,以此为抗原免疫Balb/c小鼠,经血清效价检测分析,进...
【文章来源】：河北科技师范学院河北省
【文章页数】：84 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
病猪临床症状Fig.1-1clinicalsymptomsofsickpigs
第二章PRRSVNADC30-likeNsp2蛋白单克隆抗体的制备12第二章PRRSVNADC30-likeNsp2蛋白单克隆抗体的制备2014年NADC30-like毒株暴发，给养猪业致命一击。NADC30-like毒株是PRRSV的一个新毒株，该毒株与HP-PRRSV最大的不同是在Nsp2高变区出现多个氨基酸的不连续缺失。之后的流行病学调查结果表明，NADC30-like毒株数量呈上升趋势，为此很有必要对其进行研究。Nsp2蛋白B细胞表位较丰富，亲水性较强，免疫原性较强，是目前研究的热点。通过原核表达系统进行蛋白的诱导表达是一项很成熟的技术。利用常规的细胞融合技术进行单克隆抗体的制备，并用多种方法进行验证，使得制备出的单抗特异性强，为临床从抗体水平上对NADC30-like毒株进行鉴别诊断提供技术手段。2.1试验材料2.1.1毒株、细胞与菌株毒株：PRRSVNADC30-likeQHD1毒株由本实验室分离鉴定。菌种：大肠杆菌DH5α、BL21感受态细胞均由本实验室制备并保存。细胞：SP2/0细胞和PAM细胞均由本实验室制备并保存。2.1.2载体与质粒载体：pMDTM18-T克隆载体购自大连宝生物（TaKaRa）公司（图2-1）。原核表达载体pET-32a(+)为本实验室保存（图2-2）。图2-1克隆载体pMDTM18-T限制性图谱Fig.2-1RestrictionmapofpMDTM18-Tvector
第二章PRRSVNADC30-likeNsp2蛋白单克隆抗体的制备13图2-2原核表达载体pET-32a(+)结构图Fig.2-2ConstructivemapofprokaryoticexpressionvectorpET-32a(+)2.1.3实验动物5-6周龄的Balb/c小鼠（SPF级），雌性和雄性皆有，购自湖北省医学科学院实验动物中心。2.1.4主要试剂与耗材表2-1主要试剂与耗材Table2-1Themainreagentsandconsumables试剂名称公司RNAisoPlus大连宝生物工程有限公司(TaKaRa)提取RNA的其他相关试剂如氯仿等均为分析纯反转录相关试剂如PrimeScriptTMⅡ1stStrandcDNASynthesisKit等大连宝生物工程有限公司(TaKaRa)PCR所用的各种限制性内切酶和工具酶大连宝生物工程有限公司(TaKaRa)核酸染料GoodView上海赛百盛基因技术有限公司琼脂糖LEAgarose美国HydraGeneDNA纯化回收试剂盒天根生化科技（北京）有限公司T4DNA连接酶赛默飞（Thermo）公司质粒小量提取试剂盒北京天根生物工程公司BamHI和XhoI大连宝生物（TaKaRa）公司胰蛋白胨、酵母提取物英国OXOIDS公司过硫酸铵APS琼脂粉、十二烷基硫酸钠SDSGigma公司蛋白纯化His标签镍柱PC003NTA-HisTalon无锡天演生物
【参考文献】：
期刊论文
[1]VR-2332菌株猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗功效的相关研究[J]. 张玲妮,李岑岑,Iseki H,Kawashima K,Tung N,Inui K,Ikezawa M,Shibahara T,Yamakawa M. 猪业科学. 2017(08)
[2]稳定表达猪SAMHD1蛋白的MARC-145细胞系构建与鉴定[J]. 杨莘,姜一峰,虞凌雪,刘欢,周艳君,高飞,黄勤峰,童光志. 中国动物传染病学报. 2017(04)
[3]高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒TJM-F92疫苗株对猪瘟兔化弱毒株的间隔免疫干扰研究[J]. 夏铭崎,薛青红,王炜,李真光,崔力凡,宋妮,封腾,武莹,季烨,陈凤,印春生,武华. 中国预防兽医学报. 2017(07)
[4]2015-2016年我国部分地区猪繁殖与呼吸综合征的分子流行病学调查[J]. 徐晓杰,张乔亚,谈晨,白娟,姜平. 畜牧与兽医. 2017(06)
[5]人参多糖体外抗猪生殖与呼吸综合征病毒活性[J]. 孙加节,蒋勇,习欠云,陈婷,张永亮. 中国兽医学报. 2017(04)
[6]CD163分子胞外区功能结构域在PRRSV感染PAM细胞中的作用[J]. 张莹莹,郭嘉,冯延,马思续,刘中原,冯亚琼,张留君,夏平安. 免疫学杂志. 2016(10)
[7]高致病性猪蓝耳病的诊断与防治[J]. 陈明月,孙龙杰,王峰,张源森,张海艳. 甘肃畜牧兽医. 2016(07)
[8]卷首语[J]. 王军志,沈新亮. 中国新药杂志. 2015(20)
[9]膜分离法纯化浓缩猪繁殖与呼吸综合征灭活病毒的效果试验[J]. 武桂梅,何玉友,王振辉,李鹏,郑洪娟. 中国兽医杂志. 2015(09)
[10]黑龙江省东部地区PRRSV流行毒株NSP2基因序列分析[J]. 李晓娟,李树东. 猪业科学. 2015(02)
博士论文
[1]猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株遗传进化分析及通用实时荧光RT-PCR检测方法的建立和应用[D]. 张硕.中国农业大学 2017
[2]PRRSV遗传变异分析及其nsp2蛋白的定量相互作用组学研究[D]. 宋涛.华中农业大学 2016
[3]禽呼肠孤病毒Sigma-C蛋白引起宿主细胞凋亡的分子机理研究[D]. 张志强.中国农业大学 2015
[4]猪肺炎支原体和猪鼻支原体的基因组测序与比较基因组学分析[D]. 刘威.华中农业大学 2014
[5]中国部分地区CSFV与PRRSV流行情况调查与PRRSV标记毒株的研究[D]. 蔺涛.南京农业大学 2012
[6]抗结核单克隆抗体靶向CT对比剂研制初探[D]. 张昊凌.复旦大学 2012
[7]猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白CTL表位的筛选与鉴定[D]. 张维军.中国农业科学院 2009
[8]PRRSV对猪肺泡巨噬细胞天然免疫功能影响的分子机制[D]. 蒲静.中国农业大学 2005
硕士论文
[1]规模化猪场猪繁殖与呼吸综合征诊断及综合防控[D]. 赵恒.山东农业大学 2018
[2]河北省PRRSV分子流行病学调查及流行株的分离鉴定[D]. 刘玄福.河北科技师范学院 2018
[3]基因变异及其与猪繁殖与呼吸综合征抗性相关性的研究[D]. 肖瑶.华中农业大学 2017
[4]PRRSV nsp11抑制Ⅰ型干扰素信号通路的机制研究[D]. 蔚超亮.华中农业大学 2017
[5]山羊痘病毒Vero细胞适应毒的培育和基于P32蛋白的单克隆抗体制备[D]. 易成功.扬州大学 2017
[6]高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（HuN4-F112株）ORF1a诱导中和抗体产生区域的研究[D]. 李真.中国农业科学院 2017
[7]PRRSV nsplβ单克隆抗体制备及蛋白质组学研究[D]. 黄梅瑾.华中农业大学 2016
[8]PRRSV感染对猪骨髓TCRB基因mRNA表达的影响[D]. 王晨宇.山西农业大学 2015
[9]含ITIM基序的GP5蛋白介导的信号通路研究[D]. 杜东颖.河南农业大学 2015
[10]HP-PRRSV GP5蛋白在酵母中的高效分泌表达及抗体检测iELISA方法的建立[D]. 郝立沙.中国农业科学院 2015
本文编号：2971798
【文章来源】：河北科技师范学院河北省
【文章页数】：84 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
病猪临床症状Fig.1-1clinicalsymptomsofsickpigs
第二章PRRSVNADC30-likeNsp2蛋白单克隆抗体的制备12第二章PRRSVNADC30-likeNsp2蛋白单克隆抗体的制备2014年NADC30-like毒株暴发，给养猪业致命一击。NADC30-like毒株是PRRSV的一个新毒株，该毒株与HP-PRRSV最大的不同是在Nsp2高变区出现多个氨基酸的不连续缺失。之后的流行病学调查结果表明，NADC30-like毒株数量呈上升趋势，为此很有必要对其进行研究。Nsp2蛋白B细胞表位较丰富，亲水性较强，免疫原性较强，是目前研究的热点。通过原核表达系统进行蛋白的诱导表达是一项很成熟的技术。利用常规的细胞融合技术进行单克隆抗体的制备，并用多种方法进行验证，使得制备出的单抗特异性强，为临床从抗体水平上对NADC30-like毒株进行鉴别诊断提供技术手段。2.1试验材料2.1.1毒株、细胞与菌株毒株：PRRSVNADC30-likeQHD1毒株由本实验室分离鉴定。菌种：大肠杆菌DH5α、BL21感受态细胞均由本实验室制备并保存。细胞：SP2/0细胞和PAM细胞均由本实验室制备并保存。2.1.2载体与质粒载体：pMDTM18-T克隆载体购自大连宝生物（TaKaRa）公司（图2-1）。原核表达载体pET-32a(+)为本实验室保存（图2-2）。图2-1克隆载体pMDTM18-T限制性图谱Fig.2-1RestrictionmapofpMDTM18-Tvector
第二章PRRSVNADC30-likeNsp2蛋白单克隆抗体的制备13图2-2原核表达载体pET-32a(+)结构图Fig.2-2ConstructivemapofprokaryoticexpressionvectorpET-32a(+)2.1.3实验动物5-6周龄的Balb/c小鼠（SPF级），雌性和雄性皆有，购自湖北省医学科学院实验动物中心。2.1.4主要试剂与耗材表2-1主要试剂与耗材Table2-1Themainreagentsandconsumables试剂名称公司RNAisoPlus大连宝生物工程有限公司(TaKaRa)提取RNA的其他相关试剂如氯仿等均为分析纯反转录相关试剂如PrimeScriptTMⅡ1stStrandcDNASynthesisKit等大连宝生物工程有限公司(TaKaRa)PCR所用的各种限制性内切酶和工具酶大连宝生物工程有限公司(TaKaRa)核酸染料GoodView上海赛百盛基因技术有限公司琼脂糖LEAgarose美国HydraGeneDNA纯化回收试剂盒天根生化科技（北京）有限公司T4DNA连接酶赛默飞（Thermo）公司质粒小量提取试剂盒北京天根生物工程公司BamHI和XhoI大连宝生物（TaKaRa）公司胰蛋白胨、酵母提取物英国OXOIDS公司过硫酸铵APS琼脂粉、十二烷基硫酸钠SDSGigma公司蛋白纯化His标签镍柱PC003NTA-HisTalon无锡天演生物
【参考文献】：
期刊论文
[1]VR-2332菌株猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗功效的相关研究[J]. 张玲妮,李岑岑,Iseki H,Kawashima K,Tung N,Inui K,Ikezawa M,Shibahara T,Yamakawa M. 猪业科学. 2017(08)
[2]稳定表达猪SAMHD1蛋白的MARC-145细胞系构建与鉴定[J]. 杨莘,姜一峰,虞凌雪,刘欢,周艳君,高飞,黄勤峰,童光志. 中国动物传染病学报. 2017(04)
[3]高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒TJM-F92疫苗株对猪瘟兔化弱毒株的间隔免疫干扰研究[J]. 夏铭崎,薛青红,王炜,李真光,崔力凡,宋妮,封腾,武莹,季烨,陈凤,印春生,武华. 中国预防兽医学报. 2017(07)
[4]2015-2016年我国部分地区猪繁殖与呼吸综合征的分子流行病学调查[J]. 徐晓杰,张乔亚,谈晨,白娟,姜平. 畜牧与兽医. 2017(06)
[5]人参多糖体外抗猪生殖与呼吸综合征病毒活性[J]. 孙加节,蒋勇,习欠云,陈婷,张永亮. 中国兽医学报. 2017(04)
[6]CD163分子胞外区功能结构域在PRRSV感染PAM细胞中的作用[J]. 张莹莹,郭嘉,冯延,马思续,刘中原,冯亚琼,张留君,夏平安. 免疫学杂志. 2016(10)
[7]高致病性猪蓝耳病的诊断与防治[J]. 陈明月,孙龙杰,王峰,张源森,张海艳. 甘肃畜牧兽医. 2016(07)
[8]卷首语[J]. 王军志,沈新亮. 中国新药杂志. 2015(20)
[9]膜分离法纯化浓缩猪繁殖与呼吸综合征灭活病毒的效果试验[J]. 武桂梅,何玉友,王振辉,李鹏,郑洪娟. 中国兽医杂志. 2015(09)
[10]黑龙江省东部地区PRRSV流行毒株NSP2基因序列分析[J]. 李晓娟,李树东. 猪业科学. 2015(02)
博士论文
[1]猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株遗传进化分析及通用实时荧光RT-PCR检测方法的建立和应用[D]. 张硕.中国农业大学 2017
[2]PRRSV遗传变异分析及其nsp2蛋白的定量相互作用组学研究[D]. 宋涛.华中农业大学 2016
[3]禽呼肠孤病毒Sigma-C蛋白引起宿主细胞凋亡的分子机理研究[D]. 张志强.中国农业大学 2015
[4]猪肺炎支原体和猪鼻支原体的基因组测序与比较基因组学分析[D]. 刘威.华中农业大学 2014
[5]中国部分地区CSFV与PRRSV流行情况调查与PRRSV标记毒株的研究[D]. 蔺涛.南京农业大学 2012
[6]抗结核单克隆抗体靶向CT对比剂研制初探[D]. 张昊凌.复旦大学 2012
[7]猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白CTL表位的筛选与鉴定[D]. 张维军.中国农业科学院 2009
[8]PRRSV对猪肺泡巨噬细胞天然免疫功能影响的分子机制[D]. 蒲静.中国农业大学 2005
硕士论文
[1]规模化猪场猪繁殖与呼吸综合征诊断及综合防控[D]. 赵恒.山东农业大学 2018
[2]河北省PRRSV分子流行病学调查及流行株的分离鉴定[D]. 刘玄福.河北科技师范学院 2018
[3]基因变异及其与猪繁殖与呼吸综合征抗性相关性的研究[D]. 肖瑶.华中农业大学 2017
[4]PRRSV nsp11抑制Ⅰ型干扰素信号通路的机制研究[D]. 蔚超亮.华中农业大学 2017
[5]山羊痘病毒Vero细胞适应毒的培育和基于P32蛋白的单克隆抗体制备[D]. 易成功.扬州大学 2017
[6]高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（HuN4-F112株）ORF1a诱导中和抗体产生区域的研究[D]. 李真.中国农业科学院 2017
[7]PRRSV nsplβ单克隆抗体制备及蛋白质组学研究[D]. 黄梅瑾.华中农业大学 2016
[8]PRRSV感染对猪骨髓TCRB基因mRNA表达的影响[D]. 王晨宇.山西农业大学 2015
[9]含ITIM基序的GP5蛋白介导的信号通路研究[D]. 杜东颖.河南农业大学 2015
[10]HP-PRRSV GP5蛋白在酵母中的高效分泌表达及抗体检测iELISA方法的建立[D]. 郝立沙.中国农业科学院 2015
本文编号：2971798
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