越南参变种内参基因的筛选及鲨烯环氧酶基因的功能研究

发布时间：2021-02-05 23:41

　　目的筛选并验证越南参变种不同组织部位适宜的内参基因,为越南参变种中的基因表达相关研究提供参考,同时对越南参变种的鲨烯环氧酶进行功能研究。方法基于前期研究中所获得的越南参变种转录组数据,从中筛选候选内参基因,设计特异性引物,利用qRT-PCR技术检测候选内参基因在越南参变种不同组织部位（根、根茎、茎和叶）的表达水平,并利用geNorm、NormFinder和BestKeeper 3个分析软件综合分析候选内参基因的表达稳定性。在前期的研究基础上,重新设计PvfSE2、PvfSE2^d的特异性引物,与pMal-c2X构建原核表达载体,以His-SmCPR质粒为模板,构建丹参P450还原酶（SmCPR）的原核表达载体pET-28a-SmCPR、pET-28a-SmCPR^d,将重组质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达蛋白,SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况,并利用qRT-PCR技术检测鲨烯环氧酶基因在越南参变种不同组织部位的表达水平。结果1.基于越南参变种转录组数据,总共筛选出13个候选内参基因（ACT1、ACT2、bTUB1、bTUB2、aTU... 

【文章来源】：云南中医药大学云南省

【文章页数】：80 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

越南参变种RNA琼脂糖凝胶电泳图

越南参变种内参基因的筛选及鲨烯环氧酶基因的功能研究21参基因的扩增效率E均在90.41%~104.61%之间，R2>0.9800（表2-1）。以上结果表明，13个候选内参基因的引物特异性和扩增效率良好。图2-2候选内参基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳图Fig.2-2AgarosegelelectrophoresisanalysisofPCRproductsofcandidatereferencegenesM:DL2000DNAmarker1:ACT12:ACT23:bTUB14:bTUB25:GADPH6:F-box7:CYP8:elF9:aTUB10:UBQ11:QCR12:TCTP13:EF-1a图2-3候选内参基因熔解曲线图Fig.2-3Meltingcurvesofcandidatereferencegenes2.3.3内参基因Ct值分析Ct值与基因的表达量成反比，即Ct值越大，表达量越校qRT-PCR实验结果显示，13个候选内参基因的Ct均在19～30之间，其中CYP的Ct值最小，在19~24之间；F-box的Ct值最大，在26~30之间；其他基因的Ct主要集中在20~28之间。各候选内参基因的表达量差异较大，ACT1、ACT2、TCTP、aTUB和UBQ的Ct值在不同样本间变化范围相对较小，表达较稳定，bTUB1、bTUB2、GADPH和elF的Ct值变化范围相对较大，表达差异较大（图2-4）。

越南参变种内参基因的筛选及鲨烯环氧酶基因的功能研究21参基因的扩增效率E均在90.41%~104.61%之间，R2>0.9800（表2-1）。以上结果表明，13个候选内参基因的引物特异性和扩增效率良好。图2-2候选内参基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳图Fig.2-2AgarosegelelectrophoresisanalysisofPCRproductsofcandidatereferencegenesM:DL2000DNAmarker1:ACT12:ACT23:bTUB14:bTUB25:GADPH6:F-box7:CYP8:elF9:aTUB10:UBQ11:QCR12:TCTP13:EF-1a图2-3候选内参基因熔解曲线图Fig.2-3Meltingcurvesofcandidatereferencegenes2.3.3内参基因Ct值分析Ct值与基因的表达量成反比，即Ct值越大，表达量越校qRT-PCR实验结果显示，13个候选内参基因的Ct均在19～30之间，其中CYP的Ct值最小，在19~24之间；F-box的Ct值最大，在26~30之间；其他基因的Ct主要集中在20~28之间。各候选内参基因的表达量差异较大，ACT1、ACT2、TCTP、aTUB和UBQ的Ct值在不同样本间变化范围相对较小，表达较稳定，bTUB1、bTUB2、GADPH和elF的Ct值变化范围相对较大，表达差异较大（图2-4）。


本文编号：3019777