荔枝转基因技术体系的研究

发布时间：2021-02-14 15:21

　　转基因技术育种为荔枝育种提供了新的方向,不仅可以加快育种进程,还可定向改良性状。建立、优化转基因技术体系,挖掘、鉴定功能基因及其启动子的表达和调控规律,这两方面是应用转基因技术育种的关键。本研究建立了以妃子笑荔枝胚性愈伤组织为外植体的农杆菌介导转化技术体系,以及花粉管通道法导入荔枝花序的转基因技术体系；同时,本研究还克隆获得了荔枝类甜蛋白基因（LcTLP）的启动子,并且构建了启动子缺失的植物表达载体,然后用基因枪瞬时表达法验证其表达规律。主要实验结果如下：1、以妃子笑胚性愈伤组织为外植体,进行农杆菌介导转化法体系最优条件的摸索。结果显示：农杆菌EHA105对妃子笑胚性愈伤的侵染能力强于LBA4404；重悬至浓度为OD600=0.6的菌液,侵染愈伤组织30min,25℃,共培养2天,获得的转化效果最好；重悬液中添加100nmol/L的乙酰丁香酮可以有效提高农杆菌介导转化效率；40mg/L的潮霉素和700mg/L羧苄青霉素的组合是适宜的妃子笑抗性愈伤组织筛选剂。2、准确把握荔枝花的花粉管通道伸长到达胚囊的时间,是有效运用花粉管通道法的关键前提。本研究结果显示,荔枝雌花授粉后约24h,是花粉... 

【文章来源】：海南大学海南省 211工程院校

【文章页数】：73 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
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1 引言
    1.1 转基因相关简介
        1.1.1 转基因技术
        1.1.2 转基因育种
        1.1.3 启动子的分类及应用价值
    1.2 果树转基因技术相关研究
        1.2.1 果树转基因技术的方法
        1.2.2 影响果树转基因效率的因素
        1.2.3 果树转基因技术育种中功能基因的研究及应用
        1.2.4 果树转基因育种中启动子的研究举例
    1.3 荔枝转基因技术的研究进展
        1.3.1 农杆菌介导转化法的相关研究
        1.3.2 基因枪转化法的相关研究
        1.3.3 荔枝转基因技术研究中存在的问题
        1.3.4 荔枝类甜蛋白基因启动子研究的意义
    1.4 研究目的及意义
    1.5 研究内容
2 材料与基本实验操作
    2.1 材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌种及载体
        2.1.3 酶和试剂
        2.1.4 引物合成及测序
        2.1.5 实验仪器
        2.1.6 培养基和溶液的配制
    2.2 基本实验操作
        2.2.1 提取基因组DNA
        2.2.2 凝胶纯化回收
        2.2.3 质粒提取
        2.2.4 农杆菌感受态细胞的制备
        2.2.5 冻融法转化农杆菌
        2.2.6 转化大肠杆菌DH5α
3 方法
    3.1 农杆菌介导妃子笑胚性愈伤组织转化体系的建立
        3.1.1 妃子笑胚性愈伤组织的诱导
        3.1.2 农杆菌介导转化胚性愈伤组织影响因子的研究
        3.1.3 最优条件下农杆菌介导转化胚性愈伤组织
        3.1.4 抗性愈伤组织及体胚的检测
    3.2 花粉管通道法转化荔枝的研究
        3.2.1 荔枝的开花习性及受精过程
        3.2.2 花粉管通道法转化荔枝
        3.2.3 转基因植株的检测
        3.2.4 数据统计整理分析
    3.3 荔枝类甜蛋白基因启动子的克隆及表达分析
        3.3.1 荔枝基因组DNA的提取
        3.3.2 荔枝基因组DNA扩增
        3.3.3 LcTLP启动子缺失片段的获得
        3.3.4 启动子缺失植物表达载体构建
        3.3.5 启动子缺失植物表达载体转化农杆菌
        3.3.6 基因枪法进行启动子缺失植物表达载体瞬时表达验证
4 结果
    4.1 农杆菌介导转化胚性愈伤组织影响因子的研究
        4.1.1 妃子笑胚性愈伤组织对卡那霉素的耐受性
        4.1.2 妃子笑胚性愈伤组织对潮霉素的耐受性
        4.1.3 妃子笑胚性愈伤组织对羧苄青霉素的耐受性
        4.1.4 农杆菌菌株的侵染力影响
        4.1.5 不同质粒的影响
        4.1.6 菌液浓度对转化的影响
        4.1.7 侵染时间对转化的影响
        4.1.8 乙酰丁香酮浓度对转化的影响
        4.1.9 共培养时间对转化的影响
        4.1.10 抗性愈伤组织和体胚的GUS染色检测
        4.1.11 抗性体胚的PCR检测
    4.2 花粉管通道法转化荔枝的研究
        4.2.1 雌花最适的操作时间选择
        4.2.2 PCR检测结果
        4.2.3 GUS染色结果
        4.2.4 表型比较
        4.2.5 数据统计整理分析
    4.3 荔枝类甜蛋白基因启动子的克隆及表达分析
        4.3.1 荔枝基因组DNA扩增
        4.3.2 启动子序列的生物信息学分析
        4.3.3 LcTLP启动子缺失植物表达载体的构建及基因枪瞬时表达验证
5 讨论
    5.1 农杆菌介导妃子笑胚性愈伤组织转化体系的建立
    5.2 花粉管通道法转化荔枝的研究
    5.3 荔枝类甜蛋白基因启动子的克隆及表达分析
6 结论
参考文献
缩略语表
致谢


【参考文献】：
期刊论文
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[5]荔枝基因枪转化及其GUS瞬时表达研究[J]. 桑庆亮,赖钟雄,林玉玲,陈裕坤.  热带作物学报. 2014(11)
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博士论文
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硕士论文
[1]哈密大枣、木纳格葡萄再生体系建立及遗传转化研究[D]. 徐明.新疆农业大学 2014
[2]草莓类胡萝卜素基因psy、pds遗传转化研究[D]. 陈敏氡.福建农林大学 2014
[3]海岛棉茎尖的基因枪转化体系的建立[D]. 马玲玲.石河子大学 2013
[4]YHem1基因转化香蕉提高其抗冷性的研究[D]. 韩丽晓.南京农业大学 2013
[5]iaaM基因转化‘美人指’葡萄的研究[D]. 周蓓蓓.南京农业大学 2009
[6]草莓转基因再生体系的建立及早花基因PcFT的转化[D]. 郑晶晶.华中农业大学 2008
[7]荔枝转基因胚性愈伤组织原生质体高频率再生[D]. 黄枝英.福建农林大学 2006



本文编号：3033463