拟南芥SABP3互作蛋白的鉴定及其介导的抗病机理解析
发布时间：2021-02-21 02:41
病原微生物的侵染导致的植物病害对农作物的产量和质量造成了巨大损失,促使人们不断探索植物抗病信号传导路径。有抗病能力的植物受到病原微生物侵染时,许多局部反应如乙烯的快速释放、各种防御基因的激活以及超敏反应（Hypersensitive responses,HR）等发挥着直接或间接作用。在这些反应发生之后,会进一步诱导未受侵染的植物部位表现出对多种病原体的持久抗性,即系统获得性抗性（Systemic Acquired Resistance,SAR）。而植物内源激素水杨酸（Salicylic acid,SA）是介导系统获得性抗性的重要信号。SABP3（Salicylic Acid Binding Protein 3）是一种SA结合蛋白,属于叶绿体碳酸酐酶（CA）,同时具有SA结合活性和CA酶活性,对于在病原体感染期间诱导宿主抗性至关重要。在本研究中,通过酵母文库筛选得到了与SABP3互作的蛋白——S-腺苷甲硫氨酸合成酶2（S-adenosylmethionine synthases 2,SAM2/MAT2）。它是一种甲硫氨酸腺苷转移酶,其催化甲硫氨酸产生S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl...
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：69 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
酵母双杂交载体的构建和验证
拟南芥SABP3互作蛋白的鉴定及其介导的抗病机理解析26图1酵母双杂交载体的构建和验证Fig.1ConstructionofvectorpGADT7（A）片段的获得。M，DL2000DNAMarker；1-4：由Col-0cDNA中扩增得到MAT2的cDNA片段。（A）Obtainingfragments.M,DL2000DNAMarker;1-4:ThefragmentofMAT2amplifiedfromCol-0cDNA.（B）pGADT7::MAT2的NdeI/EcoRI双酶切验证。M，DL5000DNAMarker；1-3：pGADT7::MAT2质粒。（B）VerificationofpGADT7::MAT2byNdeI/EcoRIdoubledigestion.M,DL5000DNAMarker;1-3pGADT7::MATvector.然后将构建好的AD载体和连接SABP3基因片段的BD载体通过酵母热激转化分别转化到酵母菌中。经过两缺培养基（SD/-Leu/-Trp）的筛选后选取同时具有AD、BD载体的酵母单克隆菌落转到四缺培养基（SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade）上继续培养以检测是否存在相互作用。观察发现只有同时含有pGADT7::MAT2质粒和pGBKT7::SABP3质粒的酵母菌落能够正常生长且变蓝（图2）。表明在酵母系统中SABP3能够和MAT2发生互作，而不和其同源蛋白MAT1、MAT3和MAT4互作。图2SABP3蛋白与MAT2互作Fig.2SABP3proteininteractionwithMAT2酵母双杂交（Y2H）分析中SABP3能够和MAT2互作。互作验证在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade上进行。InteractionbetweenSABP3andMAT2inyeasttwo-hybrid(Y2H)assays.TheinteractionwasvalidatedonSD/-Leu/-Trp/-His/-Ademedia.
山东农业大学硕士学位论文27在活体植物中，利用BIFC技术验证SABP3和MAT2互作的真实性。首先构建MAT2与N端YFP蛋白的瞬时表达载体pSPYNE-MAT2，以及SABP3与C端GFP蛋白的载体pSPYCE-SABP3。将构建好的载体通过电激转化至农杆菌GV3101中，配对后在烟草叶片上进行共表达。共聚焦显微镜下观察的结果显示，空pSPYNE载体与空pSPYCE载体共转化到烟草中，未能检测到绿色荧光蛋白（GFP）的荧光信号。而pSPYNE::MAT2和pSPYCE::SABP3在烟草中共表达后，在其下表皮细胞的细胞质中能够检测到清晰的GFP荧光信号（图3），这表明在植物体内SABP3与MAT2发生相互作用。图3BiFC证实SABP3和MAT2的相互作用Fig.3BiFCassayshowedtheinteractionbetweenSABP3andMAT2（A）pSPYNE::MAT2和pSPYCE::SABP3的质粒PCR检测。M，DL2000DNAMarker。（B）双分子荧光互补（BiFC）实验表明，SABP3和MAT2在细胞质中共定位。侵染表达3天后，用共聚焦显微镜对GFP信号成像。这些实验至少重复了3次，结果相似。图片标尺=20μm。（A）PlasmidPCRdetectionofpSPYNE::MAT2andpSPYCE::SABP3.M，DL2000DNAMarker.（B）Bimolecularfluorescencecomplementation(BiFC)assaysshowco-localizationofSABP3andMAT2inthecytoplasm.ConfocalmicroscopywasusedtoimageGFPsignals3daysafterinfiltration.Theseexperimentswererepeatedatleastthreetimeswithsimilarresults.Imagescale=20μm.
【参考文献】：
期刊论文
[1]乙烯介导的防卫信号途径研究进展[J]. 邹骁刚. 安徽农业科学. 2012(11)
[2]农作物乙烯合成和信号转导途径及其对抗病反应的调控[J]. 翁宇,戴小枫. 分子植物育种. 2008(04)
博士论文
[1]铜离子激发拟南芥免疫机制的研究[D]. 张宝刚.山东农业大学 2018
本文编号：3043726
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：69 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
酵母双杂交载体的构建和验证
拟南芥SABP3互作蛋白的鉴定及其介导的抗病机理解析26图1酵母双杂交载体的构建和验证Fig.1ConstructionofvectorpGADT7（A）片段的获得。M，DL2000DNAMarker；1-4：由Col-0cDNA中扩增得到MAT2的cDNA片段。（A）Obtainingfragments.M,DL2000DNAMarker;1-4:ThefragmentofMAT2amplifiedfromCol-0cDNA.（B）pGADT7::MAT2的NdeI/EcoRI双酶切验证。M，DL5000DNAMarker；1-3：pGADT7::MAT2质粒。（B）VerificationofpGADT7::MAT2byNdeI/EcoRIdoubledigestion.M,DL5000DNAMarker;1-3pGADT7::MATvector.然后将构建好的AD载体和连接SABP3基因片段的BD载体通过酵母热激转化分别转化到酵母菌中。经过两缺培养基（SD/-Leu/-Trp）的筛选后选取同时具有AD、BD载体的酵母单克隆菌落转到四缺培养基（SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade）上继续培养以检测是否存在相互作用。观察发现只有同时含有pGADT7::MAT2质粒和pGBKT7::SABP3质粒的酵母菌落能够正常生长且变蓝（图2）。表明在酵母系统中SABP3能够和MAT2发生互作，而不和其同源蛋白MAT1、MAT3和MAT4互作。图2SABP3蛋白与MAT2互作Fig.2SABP3proteininteractionwithMAT2酵母双杂交（Y2H）分析中SABP3能够和MAT2互作。互作验证在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade上进行。InteractionbetweenSABP3andMAT2inyeasttwo-hybrid(Y2H)assays.TheinteractionwasvalidatedonSD/-Leu/-Trp/-His/-Ademedia.
山东农业大学硕士学位论文27在活体植物中，利用BIFC技术验证SABP3和MAT2互作的真实性。首先构建MAT2与N端YFP蛋白的瞬时表达载体pSPYNE-MAT2，以及SABP3与C端GFP蛋白的载体pSPYCE-SABP3。将构建好的载体通过电激转化至农杆菌GV3101中，配对后在烟草叶片上进行共表达。共聚焦显微镜下观察的结果显示，空pSPYNE载体与空pSPYCE载体共转化到烟草中，未能检测到绿色荧光蛋白（GFP）的荧光信号。而pSPYNE::MAT2和pSPYCE::SABP3在烟草中共表达后，在其下表皮细胞的细胞质中能够检测到清晰的GFP荧光信号（图3），这表明在植物体内SABP3与MAT2发生相互作用。图3BiFC证实SABP3和MAT2的相互作用Fig.3BiFCassayshowedtheinteractionbetweenSABP3andMAT2（A）pSPYNE::MAT2和pSPYCE::SABP3的质粒PCR检测。M，DL2000DNAMarker。（B）双分子荧光互补（BiFC）实验表明，SABP3和MAT2在细胞质中共定位。侵染表达3天后，用共聚焦显微镜对GFP信号成像。这些实验至少重复了3次，结果相似。图片标尺=20μm。（A）PlasmidPCRdetectionofpSPYNE::MAT2andpSPYCE::SABP3.M，DL2000DNAMarker.（B）Bimolecularfluorescencecomplementation(BiFC)assaysshowco-localizationofSABP3andMAT2inthecytoplasm.ConfocalmicroscopywasusedtoimageGFPsignals3daysafterinfiltration.Theseexperimentswererepeatedatleastthreetimeswithsimilarresults.Imagescale=20μm.
【参考文献】：
期刊论文
[1]乙烯介导的防卫信号途径研究进展[J]. 邹骁刚. 安徽农业科学. 2012(11)
[2]农作物乙烯合成和信号转导途径及其对抗病反应的调控[J]. 翁宇,戴小枫. 分子植物育种. 2008(04)
博士论文
[1]铜离子激发拟南芥免疫机制的研究[D]. 张宝刚.山东农业大学 2018
本文编号：3043726
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教材专著
