牦牛AQPs对高原脑水肿抗性的分子机理

发布时间：2017-04-15 17:18

  本文关键词：牦牛AQPs对高原脑水肿抗性的分子机理，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：『目的』缺氧是许多重大疾病尤其是脑疾病发生发展的主要诱因之一,而高原低氧又一直困扰着青藏高原各种资源的探索、开发及应用。由于青藏高原极端生境的特殊性及低海拔物种的自身适应性,导致快速进入青藏高原的低海拔动物脑的代谢极易发生紊乱而形成高原脑水肿。然而,到目前为止,人类对青藏高原动物脑水和能量代谢的调控机制及其对高原脑水肿的抗性机制尚且未知。牦牛(Bos grunniens)作为唯一适应青藏高原极端低氧环境的大型哺乳动物,在其高原畜牧生产和高原适应研究中占有极其重要的地位。水通道蛋白(AQPs)中AQP4与AQP9是哺乳动物脑中表达最丰富的分子之一；其不仅在脑细胞水和能量代谢的运输中发挥着核心作用,而且在脑水肿病理生理过程中也发挥着关键的调控作用。因此,本论文以青藏高原牦牛为天然“低氧适应模型”,以低海拔黄牛为对照,初步探讨了青藏高原动物AQPs对高原脑水肿抗性的分子机理。『方法』1)基因克隆技术；2)生物信息学方法；3)实时荧光定量PCR技术；4)免疫组化方法：5)运用国内外文献数据库(如PubMed、CNKI、Google)等网络资源及相关生物信息学软件,并结合高通量差异表达实验验证,构建了“牦牛AQP4相关高原脑水肿抗性的基因调控网络”模型。『结果』(1)牦牛AQP4基因编码区结构：起始密码子为ATG,终止密码子为TGA,序列长度为966 bp,编码323个氨基酸,基因登录号为KM609432；牦牛AQP9基因编码区结构：起始密码子为ATG,终止密码子为TAA,序列长度为885 bp,编码295个氨基酸,基因登录号为KM820838。(2)成功构建了牦牛AQP4和AQP9全长CDS编码序列的真核细胞荧光表达质粒pEGFP-AQP4和pEGFP-AQP9。(3)牦牛和黄牛AQP4和AQP9生物信息学特征比对：牦牛与黄牛AQP4和AQP9氨基酸序列的同源性分别为99.8%和99.3%；牦牛和黄牛的AQP4间存在1个氨基酸的差异,即牦牛的为丝氨酸(S),而黄牛的为丙氨酸(A)；牦牛和黄牛的AQP9间存在2个氨基酸的差异,即在第9位上牦牛的为酸性氨基酸谷氨酸(E)而黄牛的为碱性氨基酸赖氨酸(K),在第273位置上牦牛的为亮氨酸(L)而黄牛的为脯氨酸(P)；牦牛和黄牛的AQP4和AQP9两种蛋白均由α-螺旋、延伸、β-折叠以及无规则卷曲4种结构组成,但该4种结构的组成及分布特征是不尽相同的,尤其是牦牛AQP4和AQP9胞质尾区a-螺旋结构均较黄牛的多；牦牛与黄牛AQP4和AQP9的蛋白均由相同数量氨基酸组成的6个跨膜区域构成；黄牛与牦牛AQP9的氨基酸序列均含有5个相同的磷酸化位点,即2个Ser磷酸化位点、1个Thr磷酸化位点及2个Tyr磷酸化位点；牦牛AQP4蛋白的疏水性除了第82号位氨基酸结构区域较黄牛的弱外其他区域的均相同,牦牛AQP9蛋白的疏水性除了第9和273号位氨基酸区域较黄牛的强外其他区域的均相同。(4)牦牛和黄牛的大脑皮质(扣带回)、海马、小脑和延髓中均有AQP4和AQP9 mRNA的表达,但其在上述物种间的表达水平是不尽相同的,即牦牛上述各功能区中该两个基因mRNA的表达水平均极显著地低于黄牛的(P0.001)。(5)牦牛和黄牛大脑皮质(扣带回)、海马、小脑和延髓中AQP9的分布特征基本与黄牛的均相似；且其在上述不同功能区中阳性反应产物表达的面积(S)和累计光密度(IOD)值的变化趋势均为SmedullaScortexScerebellumShippocampal和 IODmedullaIODcortex IODcerebellumIODhippocanpal;但是,牦牛上述各功能区AQP9阳性反应产物表达的S和IOD值均极显著地低于黄牛的(P0.01)。(6)AQPs主要与HIF-1、TNF、MAPK、VSMCNF-kβ、CAMs和cGMP-PKG七个信号通路相关联参与了“低氧缺血性脑水肿的基因调控网络”；在参与低氧缺血性脑水肿基因调控网络的16个必要因子中,在牦牛和黄牛大脑皮质中差异极显著表达的因子有ET-1、HIF-1α、NFAT5、NOS、MMP9、AQP4、AQP9、 GST、p38和、VEGF共计10个。『结论』(1)克隆得到的牦牛AQP4基因编码区序列具有特异的起始密码子(ATG)和终止密码子(TGA),长度为966bp的开放阅读框,编码323个氨基酸,获得基因登录号为KM609432；克隆得到的牦牛AQP9基因编码区含有一个长度为885bp的开放阅读框,编码295个氨基酸,起始密码子为ATG,终止密码子为TAA,获得基因登录号为KM820838。(2)通过生物信息学特征分析表明,尽管牦牛AQP4和AQP9的氨基酸序列与低海拔物种黄牛的相比较均具有极高的进化保守性,但在青藏高原极端低氧生境的长期胁迫下,这两个与脑水肿发生密切相关的关键通道蛋白在一级结构(氨基酸序列)、二级结构(疏水性)及三级结构(胞质尾区a螺旋的分布)中均发生了重要的突变,其特殊的生物信息学特征导致该“关键通道蛋白”均具有对氧较强的敏感性及其对其他因子较强的作用系数等功能,进而不仅在高原脑水肿的抗性中发挥着关键的调控作用,而且还在极端低氧生境中为牦牛脑细胞提供着充足的能量代谢底物。(3)在青藏高原极端低氧生境中,牦牛脑AQP4和AQP9以极低的表达通过减少对水的转运而在高原脑水肿的抗性中发挥着重要作用。(4)牦牛脑在青藏高原极端低氧应激下,在其对高原脑水肿抗性的基因调控网络中,AQP4、AQP9、HIF-1α、MMP9、NFAT5、NOS、ET-1、p38、GST和VEGF10个必要因子可能为参与“牦牛脑对高原脑水肿抗性基因调控网络”的关键候选基因,而其中GST和VEGF的作用还待进一步确定。但上述10关键候选基因具体参与牦牛脑水肿抗性的调控机制均有待进一步深究。
【关键词】：牦牛 脑 高原低氧适应 高原脑水肿 水通道蛋白-4 水通道蛋白-9 基因调控网络
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S823.85;Q494
【目录】：

• 中文摘要3-6
• Abstract6-12
• 第一章 绪论12-21
• 1.1 脑水通道蛋白研究进展12-17
• 1.1.1 概述12
• 1.1.2 AQPs的发现12
• 1.1.3 AQPs的结构12-13
• 1.1.4 脑AQPs的定位及表达13
• 1.1.5 脑AQPs的功能13-15
• 1.1.6 脑AQP的调节机制15-17
• 1.2 高原脑水肿17-18
• 1.2.1 脑水肿的定义与分类17-18
• 1.2.2 高原脑水肿及病理特征18
• 1.2.3 高原脑水肿的发病机制18
• 1.3 AQPs在脑水肿形成及消除过程中的作用机制18-19
• 1.4 基因调控网络19-20
• 1.5 小结20-21
• 第二章 实验材料与方法21-33
• 2.1 材料21-24
• 2.1.1 试验动物21
• 2.1.2 载体与菌株21-22
• 2.1.3 实验主要试剂22
• 2.1.4 抗体22-23
• 2.1.5 缓冲液和溶液配方23-24
• 2.1.6 实验仪器24
• 2.2 方法24-33
• 2.2.1 牦牛AQP4和AQP9基因CDS区克隆24-27
• 2.2.2 生物信息学分析27
• 2.2.3 牦牛AQP4和AQP9基因真核表达载体构建27-28
• 2.2.4 Real-Time Quantitative RCR28-29
• 2.2.5 石蜡切片与免疫组化29-30
• 2.2.6 AQPs和低氧缺血性脑水肿基因调控网络模型30-32
• 2.2.7 通过RT-PCR对模型验证分析32-33
• 第三章 实验结果33-55
• 3.1 牦牛AQP4和AQP9基因CDS区克隆33-37
• 3.1.1 牦牛脑组织总RNA提取33
• 3.1.2 牦牛AQP4和AQP9基因的扩增33-34
• 3.1.3 牦牛AQP4和AQP9基因的序列测定及分析34-37
• 3.2 AQP4和AQP9基因编码蛋白结构37-42
• 3.2.1 蛋白质氨基酸序列分析37-38
• 3.2.2 蛋白高级结构38-39
• 3.2.3 基因编码蛋白功能预测39-42
• 3.3 牦牛AQP4和AQP9基因真核表达载体的构建42-43
• 3.3.1 牦牛AQP4和AQP9基因的获取42-43
• 3.3.2 重组子鉴定43
• 3.4 AQPs基因在脑组织中的表达43-50
• 3.4.1 AQPs mRNA在脑组织中的表达43-45
• 3.4.2 不同功能脑区AQP9蛋白表达的定位和定量分析45-50
• 3.5 低氧缺血性脑水肿基因调控网络模型50-54
• 3.5.1 数据库相关因子搜索结果50
• 3.5.2 数据库分子统计结果50-51
• 3.5.3 数据库分子间相关性分析51-52
• 3.5.4 AQP4与低氧缺血性脑水肿基因调控网络52
• 3.5.5 AQP4相关低氧缺血性脑水肿基因调控网络模型52-54
• 3.6 AQP4相关低氧缺血性脑水肿调控网络模型的验证54-55
• 第四章 讨论55-61
• 4.1 在生物信息学特征方面55-57
• 4.2 在表达特征方面57
• 4.3 在基因调控网络方面57-61
• 第五章 结论61-62
• 参考文献62-78
• 附录78-79
• 作者简历79-80
• 在学期间的研究成果80-81
• 致谢81

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