Ⅰ型鸭肝炎病毒的分离鉴定及高免卵黄抗体的研制

发布时间：2017-04-16 13:14

  本文关键词：Ⅰ型鸭肝炎病毒的分离鉴定及高免卵黄抗体的研制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：鸭病毒性肝炎(Duckviral hepatitis, DVH)是雏鸭的一种高度致死性的、传播迅速的病毒性传染病。临床上以神经症状和肝脏肿大,表面有出血为特点。主要侵害6周龄以内雏鸭,特别是2日到3周龄的雏鸭最为易感,成年鸭有抵抗力。不同日龄的雏鸭发病后,死亡率各不相同,有的高达95%,有的低于15%。耐过的鸭成为僵鸭,生长和发育受到障碍。该病是危害养鸭业最为严重的传染病之一。虽然鸭肝炎鸡胚化弱毒苗和灭活苗已在全国范围内大面积推广,但是在实际生产中,鸭肝炎仍时有暴发,给养鸭业带来严重危害。而在鸭肝炎的预防和治疗上,目前养殖户主要依靠注射高免卵黄抗体,但是由于卵黄抗体生产不规范,致使卵黄抗体的质量参差不齐,效果得不到保证。本试验从临床发病雏鸭群中分离出的一株疑似鸭肝炎病毒进行了生物学鉴定和毒力的测定。利用Ⅰ型鸭肝炎病毒鉴定引物对提取的病毒RNA进行了巢式RT-PCR扩增。根据测定的病毒ELD50,将分离的毒株与Ⅰ型鸭肝炎病毒阳性血清进行中和试验。进行了雏鸭攻毒试验并用病变肝脏制作了超薄切片,观察其病毒颗粒的形态特征。用该毒株接种易感雏鸭,取病死鸭肝脏,制备组织灭活苗,并加以不同的疫苗佐剂,设置蜂胶组、黄芪组及不加佐剂的对照组三组。按照免疫程序免疫高产蛋鸡,收集高免蛋。对三组卵黄抗体的制备条件进行了摸索确定,通过中和试验对三组卵黄抗体的效价进行了测定,选择效价较高的卵黄抗体将其应用于临床发病雏鸭的治疗。试验结果表明,电镜下可观察到内质网中30nm左右圆形无囊膜的病毒颗粒。该毒株的ELD5o为10-5.659/0.2mL,分离出的病毒能够被Ⅰ型鸭肝炎病毒标准阳性血清中和,中和效价是1：79。巢式RT-PCR扩增的条带与预期相符,同源性分析与四株山东株的同源性较低。免疫后将收集三组卵黄通过中和试验进行抗体效价的测定,依次为黄芪组210.8,蜂胶组29,对照组27.82,对照组的抗体效价明显低于其他两组。卵黄抗体制备的最适pH为6.1,最适稀释度为1：10,此条件下卵黄抗体中的蛋白含量相对较高,同时发现三组卵黄抗体中的蛋白含量在在最适条件下黄芪组最高,蜂胶组次之,对照组最低。将抗体效价较高的黄芪组卵黄抗体进行大量生产并应用于临床中,发现该高免卵黄抗体对Ⅰ型鸭病毒性肝炎的治愈率很高,对发病雏鸭有很好的保护作用。本实验从临床上常发雏鸭病毒性肝炎病例出发,为高效的组织灭活苗和卵黄抗体的研制奠定了基础,为有效地预防和控制鸭病毒性肝炎的流行提供了一些技术手段和理论依据。
【关键词】：Ⅰ型鸭肝炎 分离鉴定 卵黄抗体制备
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.32
【目录】：

• 符号说明4-8
• 中文摘要8-10
• Abstract10-12
• 1 前言12-28
• 1.1 Ⅰ型鸭病毒性肝炎病原学特点12-13
• 1.2 Ⅰ型鸭肝炎流行病学13-15
• 1.2.1 传染来源及途径13-14
• 1.2.2 易感宿主14
• 1.2.3 流行特征14-15
• 1.3 Ⅰ型鸭肝炎的临床症状15
• 1.4 Ⅰ型鸭肝炎病理变化15-16
• 1.5 Ⅰ型鸭肝炎诊断技术16-19
• 1.5.1 临床综合诊断16
• 1.5.2 病毒分离16-17
• 1.5.3 血清学诊断17
• 1.5.4 分子生物学诊断17-18
• 1.5.5 鉴别诊断18-19
• 1.6 Ⅰ型鸭肝炎的防疫措施19-20
• 1.7 Ⅱ型鸭肝炎20-21
• 1.8 Ⅲ型鸭肝炎病毒21-23
• 1.9 新型鸭肝炎病毒23-24
• 1.10 鸭病毒性肝炎疫苗24-25
• 1.10.1 鸭肝炎弱毒苗24
• 1.10.2. 鸭肝炎灭活苗24
• 1.10.3 鸭肝炎活疫苗24-25
• 1.10.4 联苗25
• 1.10.5 新型鸭肝炎疫苗25
• 1.10.6 基因工程疫苗25
• 1.11 卵黄抗体25-27
• 1.11.1 卵黄抗体技术发展简史26
• 1.11.2 卵黄抗体优势分析26-27
• 1.11.3 卵黄抗体技术在预防及治疗鸭病毒性肝炎的应用27
• 1.12 研究目的27-28
• 2 材料与方法28-40
• 2.1 实验材料28-29
• 2.1.1 毒株28
• 2.1.2 主要试剂28
• 2.1.3 主要仪器设备28
• 2.1.4 主要溶液及其配制28-29
• 2.2 实验方法29-40
• 2.2.1 病毒的分离29-30
• 2.2.2 巢式RT-PCR鉴定30-35
• 2.2.3 动物回归试验35
• 2.2.4 雏鸭保护试验35
• 2.2.5 血凝试验(HA)35
• 2.2.6 病毒的电镜观察35-36
• 2.2.7 鸡胚半数致死量试验36
• 2.2.8 血清中和试验36
• 2.2.9 Ⅰ型鸭肝炎组织灭活苗的制备36-37
• 2.2.10 卵黄抗体效价的测定37
• 2.2.11 卵黄抗体溶液制备条件的确定37-38
• 2.2.12 高免卵黄抗体的制备及治疗效果38-40
• 3 结果与分析40-53
• 3.1 发病情况40
• 3.2 病毒的分离结果40-41
• 3.2.1 细菌分离结果40
• 3.2.2 病毒分离与传代结果40-41
• 3.3 巢式RT-PCR鉴定结果41-43
• 3.4 动物回归与雏鸭保护试验43
• 3.5 血凝试验结果43
• 3.6 病毒的电镜观察43-44
• 3.7 半数致死量试验结果44-45
• 3.8 中和试验结果45
• 3.9 组织灭活苗的制备45-46
• 3.10 卵黄抗体效价的测定46-48
• 3.10.1 免疫46
• 3.10.2 卵黄抗体效价的测定46-48
• 3.11 卵黄抗体溶液制备条件的确定48-51
• 3.11.1 蛋白浓度标准曲线48-49
• 3.11.2 最佳pH值确定49-50
• 3.11.3 最佳稀释倍数确定50-51
• 3.12 高免卵黄抗体的制备及治疗DVH效果51-53
• 4 讨论53-56
• 4.1 病毒的分离53
• 4.2 病毒的鉴定53
• 4.3 中和试验53-54
• 4.4 巢氏RT-PCR54
• 4.5 疫苗佐剂的选择54-55
• 4.6 高免卵黄抗体的制备55
• 4.7 鸭病毒性肝炎防治新方法55-56
• 5 结论56-57
• 参考文献57-63
• 致谢63-64
• 研究生期间发表论文64

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