柚抗坏血酸合成相关酶基因的克隆与表达研究

发布时间：2017-04-16 21:13

  本文关键词：柚抗坏血酸合成相关酶基因的克隆与表达研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：柚[Citrus maxima (Burm.) Merr.]为芸香科柑橘属植物,含有丰富的抗坏血酸(L-ascorbic acid, As A)即维生素C,食用价值极高。柚在果实发育过程中存在汁胞粒化的生理病害,严重影响了其食用品质和商品价值。抗坏血酸代谢途径与汁胞粒化相关的木质素代谢途径有密切联系。本研究克隆了柚汁胞抗坏血酸生物合成相关酶基因,并以‘红肉蜜柚’较易粒化的近中柱汁胞和不易粒化的远中柱汁胞为材料,对这些基因进行荧光定量分析,同时测定了抗坏血酸含量。主要研究结果如下：1.从柚汁胞中克隆得到了8个抗坏血酸合成相关酶基因的开放阅读框序列。其中所扩增CmGMP基因的开放阅读框片段大小为1086 bp,编码361个氨基酸；所扩增CmGME基因的开放阅读框片段大小为1128 bp,编码375个氨基酸；所扩增CmGGP基因的开放阅读框片段大小为1368 bp,编码455个氨基酸：所扩增CmGPP基因的开放阅读框片段大小为892bp,编码296个氨基酸；所扩增CmGalDH基因的开放阅读框片段大小为954 bp,编码317个氨基酸；所扩增CmGalLDH基因的开放阅读框片段大小为1807bp,编码601个氨基酸；所扩增CmPME1基因的开放阅读框片段大小为1748 bp,编码582个氨基酸。所扩增CmPG1基因的开放阅读框片段大小为1337 bp,编码445个氨基酸。这些抗坏血酸合成相关酶基因推导的氨基酸序列与其他植物的同源性都比较高。2.采用实时荧光定量PCR技术检测柚果实发育不同时期和不同部位的抗坏血酸合成相关酶基因的表达水平,并测定了抗坏血酸含量。综合试验数据分析,较易粒化的近中柱汁胞基因的表达量和AsA含量都比不易粒化的远中柱汁胞低。随着果实的发育,柚汁胞中CmGMP、CmPME1和CmGME基因的表达量逐渐升高,在花后170天表达量达到最高,然后逐渐降低。柚汁胞中CmGPP、CmGalLDH、CmPG1基因的表达量在果实发育前期没有明显变化(107天-147天),从花后147天表达量开始逐渐升高,在花后191天达到最大,然后逐渐降低。AsA含量先逐渐升高,在花后170天达到最大,然后逐渐降低,花后170天的汁胞中AsA含量是花后107天的3倍多。对两个部位的AsA含量做独立样本T检验,在花后117天以后,两者呈显著性差异(P0.05)。CmGMP、CmGME、CmGPP、CmGalLDH、 CmPME1、CmPG1等基因的表达量与AsA含量的变化趋势存在一定的一致性,特别是CmGMP、CmPME1和CmGME基因的表达量与AsA含量具有显著相关性。L-半乳糖途径可能在柚抗坏血酸生物合成中占主要地位,D-半乳糖醛酸途径也可能起到一定作用,两种途径可能相互并存。
【关键词】：红肉蜜柚 抗坏血酸 汁胞粒化 开放阅读框 荧光定量
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S666.3
【目录】：

• 缩略词8-9
• 摘要9-11
• abstract11-13
• 第一章 引言13-19
• 1 研究背景13-14
• 2 抗坏血酸合成相关研究进展14-15
• 3 抗坏血酸合成相关酶基因调控研究进展15-18
• 3.1 L-半乳糖途径相关酶基因调控研究进展15-17
• 3.2 D-半乳糖醛酸途径相关酶基因调控研究进展17-18
• 4 研究目的和意义18-19
• 第二章 柚抗坏血酸含量的测定19-23
• 1 材料与方法19
• 1.1 材料19
• 1.2 仪器与试剂19
• 1.3 方法19
• 1.3.1 样品的前处理19
• 1.3.2 流动相的配置19
• 1.3.3 高效液相色谱条件19
• 2 结果与分析19-23
• 2.1 流动相比例的优化19-20
• 2.2 标准曲线的绘制及相关性20-21
• 2.3 柚不同时期和不同部位抗坏血酸含量分析21-23
• 第三章 柚抗坏血酸合成相关酶基因的克隆和分析23-53
• 1 材料与方法23-26
• 1.1 材料23
• 1.2 仪器和试剂23
• 1.3 方法23-26
• 1.3.1 柚汁胞总RNA的提取、检测及cDNA第一链的合成23
• 1.3.2 引物设计23-24
• 1.3.3 柚抗坏血酸合成相关酶基因的克隆24-25
• 1.3.4 柚抗坏血酸合成相关酶基因序列生物信息学分析25-26
• 2 结果与分析26-53
• 2.1 CmGMP基因的克隆26-29
• 2.1.1 CmGMP基因ORF的克隆与GMP氨基酸序列系统进化树分析26-28
• 2.1.2 CmGMP蛋白理化性质预测与分析28
• 2.1.3 CmGMP蛋白跨膜结构和亚细胞定位预测与分析28-29
• 2.2 CmGME基因的克隆29-32
• 2.2.1 CmGME基因ORF的克隆与GME氨基酸序列系统进化树分析29-31
• 2.2.2 CmGME蛋白理化性质预测与分析31-32
• 2.2.3 CmGME蛋白跨膜结构和亚细胞定位预测与分析32
• 2.3 CmGGP基因的克隆32-35
• 2.3.1 CmGGP基因ORF的克隆与GGP氨基酸序列系统进化树分析32-34
• 2.3.2 CmGGP蛋白理化性质预测与分析34-35
• 2.3.3 CmGGP蛋白跨膜结构和亚细胞定位预测与分析35
• 2.4 CmGPP基因的克隆35-38
• 2.4.1 CmGPP基因ORF的克隆与GPP氨基酸序列系统进化树分析35-37
• 2.4.2 CmGPP蛋白理化性质预测与分析37
• 2.4.3 CmGPP蛋白跨膜结构和亚细胞定位预测与分析37-38
• 2.5 CmGalDH基因的克隆38-41
• 2.5.1 CmGalDH基因ORF的克隆与Ga1DH氨基酸序列系统进化树分析38-40
• 2.5.2 CmGalDH蛋白理化性质预测与分析40
• 2.5.3 CmGalDH蛋白跨膜结构和亚细胞定位预测与分析40-41
• 2.6 CmGalLDH基因的克隆41-45
• 2.6.1 CmGalLDH基因ORF的克隆与GPP氨基酸序列系统进化树分析41-44
• 2.6.2 CmGalLDH蛋白理化性质预测与分析44-45
• 2.6.3 CmGalLDH蛋白跨膜结构和亚细胞定位预测与分析45
• 2.7 CmPME1基因的克隆45-49
• 2.7.1 CmPME1基因ORF的克隆与PME氨基酸序列系统进化树分析45-48
• 2.7.2 CmPME1蛋白理化性质预测与分析48
• 2.7.3 CmPME1蛋白跨膜结构和亚细胞定位预测与分析48-49
• 2.8 CmPG1基因的克隆49-53
• 2.8.3 CmPG1基因ORF的克隆与PG氨基酸序列系统进化树分析49-51
• 2.8.4 CmPG1蛋白理化性质预测与分析51-52
• 2.8.5 CmPG1蛋白跨膜结构和亚细胞定位预测与分析52-53
• 第四章 柚抗坏血酸合成相关酶基因的表达分析53-60
• 1 材料与方法53-55
• 1.1 材料53
• 1.2 仪器和试剂53
• 1.3 方法53-55
• 1.3.1 柚汁胞总RNA的提取53
• 1.3.2 cDNA的合成53
• 1.3.3 荧光定量PCR53-55
• 2 结果与分析55-60
• 2.1 柚果实发育不同时期抗坏血酸合成相关酶基因的表达分析55-60
• 2.1.1 柚果实发育不同时期CmGMP基因的表达分析55-56
• 2.1.2 柚果实发育不同时期CmGME基因的表达分析56
• 2.1.3 柚果实发育不同时期CmGGP基因的表达分析56
• 2.1.4 柚果实发育不同时期CmGPP基因的表达分析56-57
• 2.1.5 柚果实发育不同时期CmGalDH基因的表达分析57
• 2.1.6 柚果实发育不同时期CmGalLDH基因的表达分析57-58
• 2.1.7 柚果实发育不同时期CmPME1基因的表达分析58-59
• 2.1.8 柚果实发育不同时期CmPG1基因的表达分析59-60
• 第五章 讨论60-64
• 1 抗坏血酸合成相关酶基因生物信息学分析及意义60
• 2 抗坏血酸合成相关酶基因的表达与抗坏血酸含量的关系60-64
• 第六章 总结64-65
• 参考文献65-72
• 致谢72

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本文编号：311690