绿豆CHI与CHS基因的克隆与表达研究

发布时间：2021-04-22 10:21

　　黄酮类化合物是一种重要的药用成分,不仅在植物生长发育过程中参与紫外线防护、花色形成等过程,还具有抗肿瘤、抗癌等作用。而查尔酮异构酶（CHI）和查尔酮合成酶（CHS）是黄酮类化合物合成途径中的两个限速酶,二者的表达与否对体内黄酮物质的合成具有关键的调控作用,因此,克隆出两种酶基因,对其进行功能分析,并利用基因工程技术调控黄酮物质的合成,对提高黄酮含量、增加药用价值或改变花色、提高花卉欣赏价值具有重要的意义,同时也可为植物黄酮类化合物合成途径的遗传调控研究奠定基础。CHI与CHS广泛存在于植物中,并已从多种植物中分离出这两个酶基因。然而,绿豆作为一种富含黄酮物质的重要经济作物,还未克隆出这两个酶基因,因此,本研究以此为着手点,克隆出绿豆CHI与CHS基因,并将CHI基因转化烟草和大豆,对其功能进行初步探究,具体研究结果如下：1、根据其它高等植物CHI cDNA序列保守结构域设计4条引物,结合RT-PCR,以绿豆叶片cDNA为模板,采用分段克隆的方法克隆出绿豆CHI基因片段,然后拼接成为具有完整ORF的序列。最后设计特异引物进行验证,最终获得完整ORF为669 bp的绿豆CHIcDNA全长序... 

【文章来源】：福建农林大学福建省

【文章页数】：79 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
1 文献综述
    1.1 绿豆概况
        1.1.1 绿豆的药用价值研究
        1.1.2 绿豆种质资源的研究进展
        1.1.3 绿豆基因克隆研究现状
    1.2 查尔酮异构酶研究进展
        1.2.1 查尔酮异构酶的类型特点及催化过程
        1.2.2 查尔酮异构酶基因研究进展
        1.2.3 查尔酮异构酶基因在基因工程中的应用
    1.3 查尔酮合成酶研究进展
        1.3.1 查尔酮合成酶的结构及催化机制
        1.3.2 查尔酮合成酶基因研究进展
        1.3.3 查尔酮合成酶基因的功能及应用
    1.4 获得目的基因的常用方法概述
    1.5 转基因大豆研究方法概述
    1.6 本实验研究目的与意义
2 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株及质粒
        2.1.3 药品
        2.1.4 培养基
        2.1.5 主要仪器设备
    2.2 方法
        2.2.1 绿豆叶片cDNA第一链的获得
        2.2.2 绿豆查尔酮异构酶基因的克隆
            2.2.2.1 绿豆CHI基因片段的克隆
            2.2.2.2 绿豆CHI基因片段的回收、连接及转化
            2.2.2.3 绿豆CHI基因的拼接及验证
        2.2.3 绿豆查尔酮合成酶基因的克隆
            2.2.3.1 绿豆CHS的获得
            2.2.3.2 绿豆CH8基因的回收、连接、转化及测序
            2.2.3.3 绿豆CHS基因的验证
        2.2.4 植物表达载体pFGC5941-CHI的构建及农杆菌转化
        2.2.5 农杆菌介导法转基因烟草阳性植株的获得及分子检测
        2.2.6 农杆菌介导转化大豆及阳性植株的分子检测
3 结果与分析
    3.1 绿豆查尔酮异构酶基因的克隆
        3.1.1 绿豆RNA的提取与检测
        3.1.2 绿豆CHI基因片段的获得
        3.1.3 绿豆CHI基因片段的测序结果分析
        3.1.4 绿豆CHI基因的拼接结果与验证
        3.1.5 绿豆CHI基因的获得与生物信息学分析
    3.2 绿豆查尔酮合成酶基因的克隆
        3.2.1 绿豆CHS基因的获得
        3.2.2 绿豆CHS基因的验证
        3.2.3 绿豆CHS基因的生物信息学分析
    3.3 植物表达载体的构建及农杆菌转化
        3.3.1 植物表达载体pFGC5941-CHI的构建
        3.3.2 重组载体农杆菌转化及验证
    3.4 叶盘法转化烟草
        3.4.1 重组载体的烟草遗传转化过程
        3.4.2 转基因烟草阳性植株分子检测
            3.4.2.1 转基因烟草PCR检测
            3.4.2.2 转基因烟草阳性植株的RT-PCR检测
            3.4.2.3 转基因烟草阳性植株的总黄酮含量检测
    3.5 农杆菌介导法转化大豆
        3.5.1 种胚侵染转化法转化大豆
        3.5.2 转基因大豆阳性植株的检测
            3.5.2.1 转基因大豆植株PCR检测
            3.5.2.2 转基因大豆阳性植株RT-PCR检测
            3.5.2.3 转基因大豆阳性植株的抗除草剂检测
            3.5.2.4 转基因大豆阳性植株叶片总黄酮含量检测
4 讨论
    4.1 绿豆查尔酮异构酶基因与查尔酮合成酶基因的克隆
    4.2 绿豆查尔酮异构酶基因转化烟草
    4.3 绿豆查尔酮异构酶基因转化大豆
    4.4 本文创新点
5 结论
参考文献
附录Ⅰ 培养基配方
附录Ⅱ pFGC5941载体图谱
附录Ⅲ 绿豆查尔酮异构酶与查尔酮合成酶基因及氨基酸序列
附录Ⅳ 药品缩略词
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]绿豆芽中SOD的分离纯化、固定化及性质研究[J]. 梁丽琴,程琳,李继变,段江燕.  食品研究与开发. 2014(05)
[2]中国绿豆核心种质资源在不同环境下的表型变异及生态适应性评价[J]. 王丽侠,程须珍,王素华,朱旭,刘振兴.  作物学报. 2014(04)
[3]大豆遗传转化及转基因大豆安全性研究进展[J]. 张艳,南相日,满为群,李柱刚.  中国农学通报. 2012(33)
[4]农杆菌介导的大豆子叶节非组织培养遗传转化体系优化[J]. 李丹丹,张洁,刘娜,陈琰,韩胜芳,王冬梅.  植物遗传资源学报. 2012(05)
[5]大豆遗传转化的研究进展[J]. 孙炳君.  科协论坛(下半月). 2012(08)
[6]不同植物查尔酮合成酶CHS基因的生物信息学分析[J]. 张弢.  江西农业学报. 2012(06)
[7]大豆遗传转化技术研究进展[J]. 杨向东,隋丽,李启云,杨静,邢国杰,郭东全,董英山.  大豆科学. 2012(02)
[8]绿豆萌发过程中SOD的分离纯化及性质研究[J]. 董银卯,唐冬雁,何聪芬,赵华.  化学研究与应用. 2011(06)
[9]烟草转基因工作的研究进展[J]. 贾艾敏,李立芹,程淑芬,李秋.  安徽农业科学. 2011(11)
[10]绿豆提取物的抑菌作用研究[J]. 李健,王旭,刘宁.  哈尔滨商业大学学报(自然科学版). 2010(06)

博士论文
[1]查尔酮异构酶基因过表达对新疆雪莲类黄酮生物合成的调控[D]. 李凤霞.中国科学院研究生院（植物研究所） 2006
[2]蝴蝶兰查尔酮合酶基因家族成员分子进化和差异表达调控的研究[D]. 韩颖颖.复旦大学 2005

硕士论文
[1]绿豆胰蛋白酶抑制剂活性片段的表达纯化及生物学活性研究[D]. 赵亚蕊.山西大学 2012
[2]3α-HSD/CR、aiiA和3α-HSD/CR-aiik基因转化烟草及表达分析[D]. 营文文.福建农林大学 2012
[3]绿豆中抗菌肽的分离纯化与表征及其晶体培养[D]. 吴金鸿.福州大学 2004



本文编号：3153607