野生型及突变型p53对ALV-J感染复制及致瘤机制的影响研究
发布时间：2021-04-24 06:26
J亚群禽白血病病毒（Avian leukosis viruses,ALV-J）是致禽类肿瘤性疾病的病毒。该病毒于1988年首次在肉用型种鸡群中发现,1999年我国在肉鸡中首次分离到ALV-J,此后该病毒一直在我国鸡群中广为流行,对我国家禽养殖业造成巨大的经济损失。p53作为一种抑癌基因,近年来在肿瘤性疾病中的研究非常广泛,并且发现在大多数肿瘤病的发生中p53突变为其关键致病因素,p53逐渐受到人们的关注并成为研究的明星基因。本实验室在前期研究中发现p53突变及过表达与ALV-J的感染致病密切相关。为进一步研究其致病机制,本试验以鸡成纤维细胞系DF-1细胞为模式细胞,运用靶向于鸡p53的CRISPR-Cas9系统双向敲除DF-1细胞,嘌呤霉素筛选阳性克隆细胞,获得敲除p53的DF-1细胞（p53-KO-DF-1）。将ALV-J感染DF-1和p53-KO-DF-1,通过流式细胞术、细胞基因组测序和荧光定量等方法检测p53敲除对ALV-J感染细胞的细胞周期、细胞凋亡和肿瘤相关基因表达的影响。为进一步研究p53突变对ALV-J病毒复制及致瘤机制的影响,我们构建了p53野生型及突变型真核表达质粒...
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
符号说明
中文摘要
Abstract
1 前言
1.1 J亚群禽白血病简介
1.1.1 病原特征
1.1.2 ALV-J致瘤机制
1.1.3 ALV-J流行病学
1.1.4 ALV-J感染鸡的临床表现及病理变化
1.2 p53
1.2.1 p53 基因的发现
1.2.2 p53 基因及蛋白结构
1.2.3 p53 的功能
1.2.4 p53 突变
1.3 研究目的及意义
2 材料与方法
2.1 试验材料
2.1.1 细胞和病毒
2.1.2 质粒
2.1.3 实验动物
2.1.4 主要试剂
2.1.5 试验仪器和设备
2.1.6 试剂配制
2.2 试验方法
2.2.1 DF-1 细胞复苏传代与冻存
2.2.2 ALV-J扩增和病毒效价测定
2.2.3 鸡p53 重组蛋白的表达鉴定与纯化
2.2.4 p53 多克隆抗体的制备
2.2.5 p53 多抗血清特异性的检测
2.2.6 鸡p53 基因敲除细胞系的构建
2.2.7 p53-KO-DF-1 细胞系与野生型DF-1 细胞系中ALV-J感染复制相关机制的比较
2.2.8 wtp53和mtp53对ALV-J感染复制及致瘤机制的影响
2.2.9 数据统计分析
3 结果与分析
3.1 wtp53和mtp53 重组质粒的验证
3.1.1 pEGFP-C1-p53 蛋白的免疫荧光检测
3.1.2 pEGFP-C1-p53 蛋白的Western Blot检测
3.1.3 激光共聚焦检测wtp53和mtp53在DF-1 细胞中的定位
3.2 ALV-J效价验证
3.3 兔源p53 多克隆抗体制备
3.3.1 鸡p53 重组质粒的构建及鉴定
3.3.2 测序结果分析
3.3.3 pET-His-p53 原核重组蛋白的表达鉴定
3.3.4 pET-His-p53 重组蛋白的纯化结果
3.3.5 兔源p53 多克隆抗体ELISA效价测定
3.3.6 兔源p53 多克隆抗体Western Blot鉴定结果
3.4 DF-1 细胞敲除p53 细胞系的构建
3.4.1 p53 敲除质粒Px459M-Guide-p53-KO-325-625 的构建
3.4.2 筛选DF-1 细胞的嘌呤霉素浓度确定
3.4.3 DF-1 细胞敲除p53 基因细胞系的建立
3.5 p53-KO-DF-1 细胞系与野生型DF-1 细胞系中ALV-J感染复制相关机制的比较结果
3.5.1 细胞增殖比较结果
3.5.2 病毒复制比较结果
3.5.3 肿瘤相关基因变化的比较结果
3.5.4 细胞周期变化的比较结果
3.5.5 细胞凋亡变化的比较结果
3.6 野生型及突变型p53对ALV-J致瘤机制的影响
3.6.1 野生型及突变型p53 对病毒复制的影响
3.6.2 荧光定量检测PCR对肿瘤相关基因的影响
3.6.3 流式细胞术检测细胞周期
3.6.4 流式细胞术检测细胞凋亡
3.6.5 野生型及突变型p53 蛋白对ALV-J诱导细胞自噬的影响
4 讨论
5 结论
参考文献
致谢
攻读学位期间发表论文情况
【参考文献】：
期刊论文
[1]P53对自噬调节的研究进展[J]. 黄艺锦,程德殊,徐径舟,张岳培,冯静,徐路. 吉林医药学院学报. 2020(01)
[2]p53基因及其在家禽肿瘤性疾病应用研究进展[J]. 张会霞,张桂华,张慧,牛玉娟,孙芹芹,李悦,刘思当. 动物医学进展. 2019(11)
[3]细胞周期分析新方法[J]. 方涵书,郎明非,孙晶. 分析化学. 2019(09)
[4]Tunel检测凋亡细胞后直接行HE染色法探讨[J]. 卜文超,成家茂,于亚男,刘人郡,马楚晗,吴朋鑫. 世界最新医学信息文摘. 2019(04)
[5]近年来ALV-J的国内外研究进展[J]. 徐晴晴,王峰,孙培,王文秀. 中国兽医学报. 2018(09)
[6]组织p53蛋白、血清p53蛋白及其抗体的相互关系与临床应用进展[J]. 韩旭,翟城. 中国临床实用医学. 2017(4)
[7]细胞周期及其调控[J]. 李春,黄警. 福建医药杂志. 2013(05)
[8]活毒疫苗中禽白血病病毒污染的检测方法探讨[J]. 胡晓苗,张丹俊,侯宏艳,戴银,赵瑞宏,潘孝成,周学利,沈学怀,朱传明. 安徽农业科学. 2013(26)
[9]抑癌基因p53与细胞自噬[J]. 钱帅伟,漆正堂,支彩霞,丁树哲. 生命的化学. 2011(05)
[10]自身抗体在癌症早期检测中的应用[J]. 王海霞,钟理,柳峰松,曾伟,葛昆. 肿瘤学杂志. 2008(03)
博士论文
[1]锌与p53通过线粒体HK2诱导前列腺癌细胞凋亡机制的研究[D]. 薛亚楠.吉林大学 2019
[2]两J亚群禽白血病病毒株致病特性的比较病理学研究[D]. 屈亚锦.山东农业大学 2016
[3]J亚群禽白血病病毒致病性增强的分子机制[D]. 王琦.中国农业科学院 2014
[4]A亚群禽白血病病毒不同分离株的基因组和生物学特性比较[D]. 张青婵.山东农业大学 2010
硕士论文
[1]miR-125b和miR-221在J亚群禽白血病病毒感染过程中作用机制研究[D]. 任超琪.中国农业科学院 2018
[2]ALV-J感染致病过程中p53基因突变及其作用研究[D]. 张桂华.山东农业大学 2018
本文编号：3156856
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
符号说明
中文摘要
Abstract
1 前言
1.1 J亚群禽白血病简介
1.1.1 病原特征
1.1.2 ALV-J致瘤机制
1.1.3 ALV-J流行病学
1.1.4 ALV-J感染鸡的临床表现及病理变化
1.2 p53
1.2.1 p53 基因的发现
1.2.2 p53 基因及蛋白结构
1.2.3 p53 的功能
1.2.4 p53 突变
1.3 研究目的及意义
2 材料与方法
2.1 试验材料
2.1.1 细胞和病毒
2.1.2 质粒
2.1.3 实验动物
2.1.4 主要试剂
2.1.5 试验仪器和设备
2.1.6 试剂配制
2.2 试验方法
2.2.1 DF-1 细胞复苏传代与冻存
2.2.2 ALV-J扩增和病毒效价测定
2.2.3 鸡p53 重组蛋白的表达鉴定与纯化
2.2.4 p53 多克隆抗体的制备
2.2.5 p53 多抗血清特异性的检测
2.2.6 鸡p53 基因敲除细胞系的构建
2.2.7 p53-KO-DF-1 细胞系与野生型DF-1 细胞系中ALV-J感染复制相关机制的比较
2.2.8 wtp53和mtp53对ALV-J感染复制及致瘤机制的影响
2.2.9 数据统计分析
3 结果与分析
3.1 wtp53和mtp53 重组质粒的验证
3.1.1 pEGFP-C1-p53 蛋白的免疫荧光检测
3.1.2 pEGFP-C1-p53 蛋白的Western Blot检测
3.1.3 激光共聚焦检测wtp53和mtp53在DF-1 细胞中的定位
3.2 ALV-J效价验证
3.3 兔源p53 多克隆抗体制备
3.3.1 鸡p53 重组质粒的构建及鉴定
3.3.2 测序结果分析
3.3.3 pET-His-p53 原核重组蛋白的表达鉴定
3.3.4 pET-His-p53 重组蛋白的纯化结果
3.3.5 兔源p53 多克隆抗体ELISA效价测定
3.3.6 兔源p53 多克隆抗体Western Blot鉴定结果
3.4 DF-1 细胞敲除p53 细胞系的构建
3.4.1 p53 敲除质粒Px459M-Guide-p53-KO-325-625 的构建
3.4.2 筛选DF-1 细胞的嘌呤霉素浓度确定
3.4.3 DF-1 细胞敲除p53 基因细胞系的建立
3.5 p53-KO-DF-1 细胞系与野生型DF-1 细胞系中ALV-J感染复制相关机制的比较结果
3.5.1 细胞增殖比较结果
3.5.2 病毒复制比较结果
3.5.3 肿瘤相关基因变化的比较结果
3.5.4 细胞周期变化的比较结果
3.5.5 细胞凋亡变化的比较结果
3.6 野生型及突变型p53对ALV-J致瘤机制的影响
3.6.1 野生型及突变型p53 对病毒复制的影响
3.6.2 荧光定量检测PCR对肿瘤相关基因的影响
3.6.3 流式细胞术检测细胞周期
3.6.4 流式细胞术检测细胞凋亡
3.6.5 野生型及突变型p53 蛋白对ALV-J诱导细胞自噬的影响
4 讨论
5 结论
参考文献
致谢
攻读学位期间发表论文情况
【参考文献】：
期刊论文
[1]P53对自噬调节的研究进展[J]. 黄艺锦,程德殊,徐径舟,张岳培,冯静,徐路. 吉林医药学院学报. 2020(01)
[2]p53基因及其在家禽肿瘤性疾病应用研究进展[J]. 张会霞,张桂华,张慧,牛玉娟,孙芹芹,李悦,刘思当. 动物医学进展. 2019(11)
[3]细胞周期分析新方法[J]. 方涵书,郎明非,孙晶. 分析化学. 2019(09)
[4]Tunel检测凋亡细胞后直接行HE染色法探讨[J]. 卜文超,成家茂,于亚男,刘人郡,马楚晗,吴朋鑫. 世界最新医学信息文摘. 2019(04)
[5]近年来ALV-J的国内外研究进展[J]. 徐晴晴,王峰,孙培,王文秀. 中国兽医学报. 2018(09)
[6]组织p53蛋白、血清p53蛋白及其抗体的相互关系与临床应用进展[J]. 韩旭,翟城. 中国临床实用医学. 2017(4)
[7]细胞周期及其调控[J]. 李春,黄警. 福建医药杂志. 2013(05)
[8]活毒疫苗中禽白血病病毒污染的检测方法探讨[J]. 胡晓苗,张丹俊,侯宏艳,戴银,赵瑞宏,潘孝成,周学利,沈学怀,朱传明. 安徽农业科学. 2013(26)
[9]抑癌基因p53与细胞自噬[J]. 钱帅伟,漆正堂,支彩霞,丁树哲. 生命的化学. 2011(05)
[10]自身抗体在癌症早期检测中的应用[J]. 王海霞,钟理,柳峰松,曾伟,葛昆. 肿瘤学杂志. 2008(03)
博士论文
[1]锌与p53通过线粒体HK2诱导前列腺癌细胞凋亡机制的研究[D]. 薛亚楠.吉林大学 2019
[2]两J亚群禽白血病病毒株致病特性的比较病理学研究[D]. 屈亚锦.山东农业大学 2016
[3]J亚群禽白血病病毒致病性增强的分子机制[D]. 王琦.中国农业科学院 2014
[4]A亚群禽白血病病毒不同分离株的基因组和生物学特性比较[D]. 张青婵.山东农业大学 2010
硕士论文
[1]miR-125b和miR-221在J亚群禽白血病病毒感染过程中作用机制研究[D]. 任超琪.中国农业科学院 2018
[2]ALV-J感染致病过程中p53基因突变及其作用研究[D]. 张桂华.山东农业大学 2018
本文编号：3156856
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/zaizhiyanjiusheng/3156856.html
教材专著
